?小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞永生化說明書
一、細(xì)胞培養(yǎng)條件
專用培養(yǎng)基（收集T25瓶完培做對比培養(yǎng)）
傳代步驟中的終止消化請自配完培（DMEM或1640+10%FBS）5-6ml去終止消化，但正常培養(yǎng)的話還是需要用專培。
? ? 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，對骨髓中的造血干細(xì)胞（HSC）不僅有機(jī)械支持作用，還能分泌多種生長因子（如IL-6，IL-11，LIF，M-CSF及SCF等）來支持造血。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)具有多向分化潛能，能促進(jìn)間充質(zhì)組織的再生，如：骨、軟骨、肌肉、韌帶、肌腱、脂肪及基質(zhì)等組織。在骨髓中，BMSCs占骨髓有核細(xì)胞總數(shù)的0.001%~0.1%，含量極低。而同時(shí)，由于組織工程需要大量的種子細(xì)胞，從嚙齒類動(dòng)物骨髓分離BMSCs的技術(shù)上的難度限制了許多實(shí)驗(yàn)的開展。體外分離培養(yǎng)純度高、活力強(qiáng)、生物特性均一的BMSCs對組織工程及細(xì)胞的體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)顯得至關(guān)重要。
該細(xì)胞通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式攜帶SV40基因。
二、細(xì)胞收貨后處理
A、復(fù)蘇細(xì)胞處理方法：培養(yǎng)至良好狀態(tài)后灌滿完全培養(yǎng)液并封好瓶口是運(yùn)輸細(xì)胞的最好辦法。收到細(xì)胞用75%酒精噴灑整個(gè)細(xì)胞瓶，嚴(yán)格無菌后將細(xì)胞瓶放置培養(yǎng)箱中靜置2-4小時(shí)以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。靜置后顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，并對細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照保存（最好40x,100x,200x各一張），前三天照片是重要售后依據(jù)，不提供照片默認(rèn)收到狀態(tài)良好。
B、凍存細(xì)胞處理方法：收到細(xì)胞后，觀察泡沫箱中干冰是否有剩余，凍存管是否完好無損是否有解凍情況，若發(fā)現(xiàn)干冰完全汽化或凍存管有解凍破損現(xiàn)象，請及時(shí)拍照并與我們聯(lián)系。如果細(xì)胞簽收三天內(nèi)未與我們聯(lián)系，則默認(rèn)為收貨良好。復(fù)蘇第一管如有活性問題，請及時(shí)聯(lián)系我們，技術(shù)人員與您溝通指導(dǎo)后再復(fù)蘇第?二管，未與我方聯(lián)系擅自復(fù)蘇第二管出現(xiàn)問題不予售后。
三、細(xì)胞培養(yǎng)步驟
a、細(xì)胞傳代：如細(xì)胞密度超過80%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)，步驟如下：
1) 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次；
2) 加1mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置培養(yǎng)箱中消化 1min ，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后，加5-6ml含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化；
3) 輕輕吹打細(xì)胞，完全脫落后吸出至離心管中，1000 rpm離心5-8min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL完全培養(yǎng)基后吹勻；
4) 按5-6mL每瓶補(bǔ)加完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞懸液按1:2的比例分到新的含5-6 mL完全培養(yǎng)基的6cm培養(yǎng)皿中或者T25培養(yǎng)瓶中。
（即1個(gè)T25瓶傳代接種至2個(gè)T25瓶或者2個(gè)6cm的培養(yǎng)皿）
b、細(xì)胞凍存：細(xì)胞收集參照傳代步驟，按凍存數(shù)量（推薦每支凍存管5×106左右細(xì)胞數(shù)量凍存），加入1ml的我司無血清凍存液（貨號(hào)：C7001），輕輕混勻后，放-80℃冰箱，24小時(shí)后轉(zhuǎn)入液氮罐中。
C、細(xì)胞復(fù)蘇：從液氮罐或-80℃冰箱中找到需要復(fù)蘇的細(xì)胞，水浴鍋提前打開預(yù)熱37℃。
1) 將凍存細(xì)胞在37℃水浴中迅速搖晃解凍；
2) 將凍存管中的細(xì)胞移至含5ml完全培養(yǎng)基的離心管中，1000 rpm離心5min；
3) 棄去上清液，補(bǔ)加5mL完全培養(yǎng)基后吹勻，接種于T25培養(yǎng)瓶中或6cm皿中，培養(yǎng)過夜，第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
四、注意事項(xiàng)：有些細(xì)胞貼壁不牢，在運(yùn)輸過程中細(xì)胞容易脫落，這是正?，F(xiàn)象。如脫落較多可將培養(yǎng)瓶所有培養(yǎng)液收集至離心管，1000rpm離心5-8min，收集上清作過渡培養(yǎng)，沉淀加入胰酶1-2ml，輕輕吹打，重懸，消化1-2分鐘后，加5ml完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)。再離心，棄上清，加1-2ml完全培養(yǎng)基重懸。然后按1:2比例進(jìn)行分瓶傳代，補(bǔ)充新的完全培養(yǎng)基至5-6ml/瓶，最后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。