PMA qPCR 活菌檢測(cè)試劑盒（No Primer，無(wú)特異性引物通用型），是依托光反應(yīng)型高親和 DNA 嵌入染料開(kāi)發(fā)的廣譜活細(xì)胞核酸檢測(cè)成套試劑，試劑盒核心功能組分 PMA 為雙鏈 DNA 高親和力光敏染料，游離狀態(tài)熒光信號(hào)微弱，嵌入雙鏈 DNA 后熒光強(qiáng)度顯著提升；PMA 不具備完整細(xì)胞膜穿透能力，可特異性標(biāo)記膜破損死細(xì)胞基因組 DNA，經(jīng)藍(lán)光光解實(shí)現(xiàn)不可逆共價(jià)修飾，從源頭阻斷死細(xì)胞核酸擴(kuò)增干擾，完美解決普通 qPCR 無(wú)法區(qū)分活菌、死菌 DNA，檢測(cè)結(jié)果虛高失真的行業(yè)痛點(diǎn)。本試劑盒采用標(biāo)準(zhǔn)化復(fù)配工藝生產(chǎn)，配套優(yōu)化 qPCR 擴(kuò)增預(yù)混液、專用 PMA 染料儲(chǔ)存液、無(wú)酶稀釋緩沖體系；全程嚴(yán)控核酸酶、內(nèi)毒素、擴(kuò)增抑制雜質(zhì)，無(wú)廣譜引物限定，可由客戶自主搭配目標(biāo)物種特異性上下游引物，批次染料交聯(lián)活性、qPCR 擴(kuò)增效率、光解穩(wěn)定性、死 DNA 阻斷效果高度統(tǒng)一。廣泛適配細(xì)菌、生物膜菌群、酵母菌、真菌、病毒、真核細(xì)胞樣本，兼容 qPCR、NGS 二代測(cè)序、Sanger 測(cè)序、LAMP 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增多種核酸檢測(cè)平臺(tái)，大量應(yīng)用于食品安全微生物篩查、飲用水環(huán)境微生物監(jiān)測(cè)、消毒效果驗(yàn)證、生物膜活菌定量、病原微生物活細(xì)胞溯源、消毒藥劑藥效評(píng)價(jià)、環(huán)境微生物多樣性分析、高校微生物分子實(shí)訓(xùn)等食品檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、公共衛(wèi)生、微生物科研場(chǎng)景。
試劑盒液體組分呈澄清橙紅色，無(wú)沉淀、無(wú)絮狀雜質(zhì)；PMA 染料光敏特性穩(wěn)定，配套 qPCR 預(yù)混液擴(kuò)增靈敏度高、非特異性擴(kuò)增少；整套試劑密封 - 20℃避光冷凍儲(chǔ)存，全程避光操作，避免自然光、紫外照射造成染料提前失活，規(guī)范避光儲(chǔ)存保質(zhì)期 12 個(gè)月，稀釋工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。本品為無(wú)引物通用型活菌甄別試劑盒，區(qū)別于菌種定制引物款試劑盒，無(wú)物種限制，適配全類型微生物、真核細(xì)胞樣本檢測(cè)；無(wú)需復(fù)雜體系優(yōu)化，僅需搭配自購(gòu)目標(biāo)引物即可完成整套活菌定量流程；光解后游離染料自動(dòng)水解失活，不會(huì)抑制后續(xù)核酸擴(kuò)增反應(yīng)，是食品、環(huán)境領(lǐng)域通用化活菌分子定量核心標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)試劑盒。
二、作用機(jī)制
1、雙鏈 DNA 高親和熒光嵌入機(jī)制
核心染料 PMA 屬于嵌入型光敏核酸染料，游離狀態(tài)分子熒光微弱；當(dāng)接觸雙鏈 DNA 骨架時(shí)，染料嵌入堿基對(duì)間隙，分子構(gòu)象發(fā)生改變，釋放高強(qiáng)度特征熒光，可同步輔助判斷樣本核酸富集程度；對(duì)雙鏈 DNA 結(jié)合特異性遠(yuǎn)高于單鏈核酸，幾乎不干擾 RNA 單鏈分子，適配基因組 DNA 靶向擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。
2、細(xì)胞膜選擇性滲透甄別機(jī)制
PMA 染料無(wú)法穿透結(jié)構(gòu)完整的活細(xì)胞膜，僅能通過(guò)破損、失活的死細(xì)胞細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)，與死細(xì)胞基因組雙鏈 DNA 結(jié)合；活菌完整細(xì)胞膜形成天然屏障，阻擋 PMA 進(jìn)入，活菌 DNA 保持原始未修飾狀態(tài)，可正常進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)活 / 死細(xì)胞 DNA 物理分離標(biāo)記。
3、藍(lán)光誘導(dǎo)不可逆共價(jià)交聯(lián)修飾機(jī)制
結(jié)合死細(xì)胞 DNA 的 PMA 染料在 464 nm 藍(lán)光照射光解后，分子自帶光反應(yīng)疊氮基團(tuán)轉(zhuǎn)化為高活性氮烯自由基；自由基與 DNA 骨架周邊烴基發(fā)生特異性反應(yīng)，生成穩(wěn)定共價(jià)氮 - 碳化學(xué)鍵，對(duì)死細(xì)胞 DNA 形成永久性化學(xué)修飾。交聯(lián)修飾后的 DNA 溶解性大幅下降，核酸提取過(guò)程中隨細(xì)胞殘?jiān)恋韥G失，完全喪失 PCR 模板擴(kuò)增能力，死細(xì)胞信號(hào)被徹底屏蔽。
4、游離染料自動(dòng)水解除抑制機(jī)制
樣本體系內(nèi)未結(jié)合 DNA 的游離 PMA 分子，經(jīng)強(qiáng)光持續(xù)照射后可與水分子發(fā)生水解反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為無(wú)交聯(lián)活性的羥胺衍生物；水解產(chǎn)物喪失 DNA 共價(jià)結(jié)合能力，不會(huì)對(duì)后續(xù) qPCR、測(cè)序、LAMP 等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)生抑制作用，無(wú)需額外純化去除多余染料，簡(jiǎn)化前處理流程。
5、多平臺(tái)核酸檢測(cè)兼容機(jī)制
經(jīng) PMA 前處理的活菌核酸模板結(jié)構(gòu)完整、無(wú)化學(xué)修飾，可直接投入實(shí)時(shí)熒光定量 qPCR 開(kāi)展活菌絕對(duì)定量；同時(shí)適配 NGS 高通量微生物群落測(cè)序、Sanger 菌種鑒定測(cè)序、LAMP 等溫快速擴(kuò)增技術(shù)，一套前處理流程支撐多維度分子檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)環(huán)境、食品樣本活菌高通量篩查。
三、主要應(yīng)用領(lǐng)域
1、食品微生物安全活菌定量檢測(cè)生鮮肉類、乳制品、飲用水、即食食品中致病菌、腐敗活菌定量，區(qū)分活菌與死亡菌體 DNA，避免滅菌殘留死菌造成假陽(yáng)性超標(biāo)判定。2、水體與環(huán)境微生物監(jiān)測(cè)地表水、地下水、污水處理廠水樣、土壤樣本活菌群落檢測(cè)，消毒工藝滅活效果驗(yàn)證，生物膜內(nèi)活菌群定量分析。3、消毒藥劑殺菌藥效評(píng)價(jià)酒精、含氯消毒劑、抗菌材料滅活實(shí)驗(yàn)，精準(zhǔn)定量存活微生物數(shù)量，客觀評(píng)估消毒產(chǎn)品抑菌、殺菌性能。4、微生物生物膜活體菌群研究管道、醫(yī)療器械表面生物膜活菌檢測(cè)，解析生物膜耐藥存活菌群豐度，支撐抑菌新材料研發(fā)。5、多技術(shù)平臺(tái)核酸測(cè)序與擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)搭配自主特異性引物，開(kāi)展活菌樣本 qPCR 絕對(duì)定量、微生物 16S rRNA 高通量測(cè)序、目標(biāo)基因 Sanger 測(cè)序、LAMP 快速篩查。6、真菌、酵母、病毒、真核活細(xì)胞檢測(cè)霉菌、酵母菌活菌計(jì)數(shù)，病毒完整感染性顆粒甄別，體外培養(yǎng)真核細(xì)胞存活分子定量實(shí)驗(yàn)。7、微生物分子檢測(cè)教學(xué)實(shí)訓(xùn)
活死菌甄別原理實(shí)操、PMA 光解前處理、qPCR 活菌定量全套教學(xué)實(shí)驗(yàn)，試劑批次穩(wěn)定，檢測(cè)重復(fù)性優(yōu)異。
四、使用方法與注意事項(xiàng)
使用方法
樣本前處理：水樣、食品勻漿、菌懸液樣本離心富集菌體，按試劑盒說(shuō)明書(shū)配比加入 PMA 工作液，避光室溫孵育；將樣本置于 464 nm 藍(lán)光光源下避光強(qiáng)光照射充分光解，完成死細(xì)胞 DNA 共價(jià)交聯(lián)；核酸提?。汗饨馔瓿珊蟪Ｒ?guī)裂解提取基因組 DNA，交聯(lián)修飾的死細(xì)胞 DNA 隨殘?jiān)恋韥G棄，僅留存活菌完整 DNA；擴(kuò)增檢測(cè)：試劑盒配套通用 qPCR 預(yù)混液，體系中自行添加物種特異性上下游引物、提取活菌模板，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn) qPCR 擴(kuò)增程序，通過(guò)熒光 Ct 值計(jì)算樣本活菌載量；測(cè)序 / LAMP 拓展應(yīng)用：提取純化活菌 DNA 可直接構(gòu)建 NGS 文庫(kù)、開(kāi)展 Sanger 測(cè)序，或搭配等溫?cái)U(kuò)增試劑完成現(xiàn)場(chǎng)快速活菌篩查。
注意要點(diǎn)
整套試劑全程避光儲(chǔ)存、避光操作，自然光、紫外光會(huì)提前激活 PMA 疊氮基團(tuán)，喪失死細(xì)胞 DNA 阻斷活性；PMA 染料溶液見(jiàn)光易分解，工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，不可長(zhǎng)期常溫放置；藍(lán)光光解需嚴(yán)格控制光照時(shí)長(zhǎng)與光源波長(zhǎng)，光照不足會(huì)導(dǎo)致交聯(lián)不完全，死菌信號(hào)去除不徹底；本試劑盒不含物種特異性引物，客戶需根據(jù)檢測(cè)目標(biāo)自行合成上下游引物，引物質(zhì)量直接影響擴(kuò)增靈敏度；操作全程無(wú)酶環(huán)境，避免外源核酸酶降解活菌模板，造成定量數(shù)值偏低；僅限實(shí)驗(yàn)室體外科研、食品環(huán)境檢測(cè)使用，不可用于人體臨床診斷；PMA 染料具有光敏刺激性，操作佩戴手套護(hù)目鏡，避免皮膚直接接觸；出現(xiàn)染料液體褪色、光解后擴(kuò)增無(wú) Ct 差值，判定試劑光敏組分失效，禁止用于定量檢測(cè)；整套試劑無(wú)需額外優(yōu)化配方，標(biāo)準(zhǔn)化配比可直接投料，適配各類微生物樣本前處理。
五、總結(jié)與展望
PMA qPCR 活菌檢測(cè)試劑盒（No Primer）憑借高親和雙鏈 DNA 光敏染料、細(xì)胞膜選擇性活死甄別、藍(lán)光不可逆共價(jià)阻斷死菌擴(kuò)增、游離染料自動(dòng)水解無(wú)擴(kuò)增抑制、無(wú)引物通用廣譜適配、兼容 qPCR/NGS/LAMP 多檢測(cè)平臺(tái)等核心優(yōu)勢(shì)，成為食品、環(huán)境領(lǐng)域通用型活菌分子定量標(biāo)桿試劑。有效解決傳統(tǒng)普通 PCR 無(wú)法區(qū)分活死微生物、檢測(cè)結(jié)果虛高、單一試劑盒僅適配特定菌種、多余染料干擾擴(kuò)增、前處理流程繁瑣等行業(yè)檢測(cè)痛點(diǎn)，適配第三方食品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室、環(huán)境監(jiān)測(cè)站、消毒產(chǎn)品研發(fā)企業(yè)、高校微生物研究院、疾控公共衛(wèi)生平臺(tái)全場(chǎng)景微生物活菌篩查需求。
當(dāng)前依托該通用型 PMA 活菌檢測(cè)試劑盒搭建的標(biāo)準(zhǔn)化前處理 - 核酸擴(kuò)增體系，持續(xù)支撐食品致病菌安全管控、水體環(huán)境菌群動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)、新型消毒抗菌材料研發(fā)、生物膜耐藥微生物機(jī)制、微生物高通量測(cè)序群落分析等主流科研與檢測(cè)課題。隨著快速微生物現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、高通量環(huán)境微生物篩查、食品致病菌精準(zhǔn)定量技術(shù)持續(xù)升級(jí)，這款無(wú)引物廣譜 PMA 活菌檢測(cè)試劑盒將在全域微生物活細(xì)胞甄別、多平臺(tái)核酸分子檢測(cè)、消毒滅活效果精準(zhǔn)評(píng)價(jià)領(lǐng)域發(fā)揮不可替代作用，為食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)、公共衛(wèi)生微生物檢測(cè)方向標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)體系搭建，提供交聯(lián)活性穩(wěn)定、廣譜通用、操作簡(jiǎn)便的成套分子檢測(cè)試劑保障。