? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ???青霉素快速檢測試劑盒
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 使用說明書
一、檢測原理
???????本試劑盒是利用競爭ELISA方法，在酶標板微孔上預包被抗青霉素抗原。檢測時，加入標準品或樣品溶液，青霉素受體和抗體以及酶標記物，包被抗原和加入樣本中的青霉素藥物競爭性地與青霉素受體抗體結(jié)合后，再與酶標記物形成抗原抗體復合物，用TMB底物顯色；加入反應終止液，在450nm波長酶標儀下進行檢測，樣品中的青霉素濃度與吸收光強度成反比。
二、檢測范圍
????本試劑盒是應用ELISA技術(shù)研發(fā)的藥物殘留檢測產(chǎn)品,與儀器分析技術(shù)比較，能經(jīng)濟、快速地檢測出畜禽動物組織、蜂蜜、牛奶、飲用水中的青霉素殘留
三、試試劑盒技術(shù)指標
規(guī) ?????格：96孔/盒
靈 敏 度： 0.1ppb
檢測時間：75min
樣本檢測下限：
畜禽組 織（雞、鴨、豬肉等）……………0.1ppb
細胞培養(yǎng)液……………………………………6ppb
樣本回收率
畜禽組 織（雞、鴨、豬肉等）……………80% ±10%
細胞培養(yǎng)液……………………………………80% ±15%
反應率
青霉素………………………………………100%
四、試劑盒組成
1、?微量測試孔：1×96孔板（12條×8孔）
2、?標準溶液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb
3、?酶標記物 ??????7ml………………………紅色帽
4、?200×濃縮受體 50ul……………………離心管
5、?抗體工作液 ??7ml ………………………紅色帽
6、?底物A液 ?????7ml ………………………棕色帽
7、?底物B液 ????7ml ?…………………… 黑色帽
8、?終 ?止 ?液 ????7ml ?…………………… 黃色帽
9、?20×濃縮洗滌液40 ml ?……………… 白色帽
10、?10× 濃縮復溶液 ?50ml ·………………???藍色帽
11、?蓋板膜……………………………………1張
12、?說明書 ……………………………………1份
【所用儀器、試劑】 ??
具備的儀器：微孔酶標儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、
振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）
微量移液器：單道20μl-200μl，100μl-1000μl、多道250μl
（2）試劑（高檢測限處理方法時使用）：乙腈、正己烷、氯化鈉
【實驗前溶液配制】
配液1、1×復溶液：
????????????????將10×濃縮復溶液用去離子水以1：9稀釋（1份10×濃縮復溶液+9份去離子水），用于樣本提取和稀釋。
配液2、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照 1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
配液3?、受體工作液的配制：
取5ul的200X濃縮受體，加入1000ul配制好的1×復溶液混勻即可，或按所需用量配制抗體。
【樣本前處理步驟】 ??
樣本前處理須知
處理任何樣本時，都必須注意：
（1）本試劑盒所檢測的組織樣本包括：動物組織、禽類和水產(chǎn)組織。eg:雞、鴨、牛、兔、魚、蝦等。
（2）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。
（3）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。
（A）組織低檢測限快速處理方法（檢測限1.5ppb）
1、稱取1.0±0.05g均質(zhì)過的組織樣本于10ml離心管中；加入4ml配好的1×復溶液進行提取，充分振蕩2min，4000r/min以上速度離心5min
2、取50μl液體用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：5倍
（B）??組織高檢測限處理方法（檢測限0.1ppb）
1、?用均質(zhì)器均質(zhì)樣本；稱取3±0.05g樣本于50ml離心管中，加入1g氯化鈉，再加入6ml乙腈，用振蕩器振蕩5分鐘；4000轉(zhuǎn)/分以上,室溫離心10分鐘；
2、?取上清液2ml至干凈玻璃試管中，于65℃水浴下氮氣/空氣吹干；
3、?加入0.5?ml正己烷溶解干燥的殘留物，再加0.5ml配好的1×復溶液強烈振蕩混合30s，室溫4000r/min以上離心5min。
4、?取50 μl下層相用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：0.5 ?
（c）細胞培養(yǎng)液
1、取1ml細胞培養(yǎng)液于離心管中，在3000r/min，4℃離心10min，去除上層脂肪。
2、取50μl上清液，加入950μl?稀釋后的復溶液混勻，混合30s
3、取50μl液體用于分析。
??????????樣本稀釋倍數(shù)：20倍
【酶聯(lián)免疫檢測步驟】
1、?從4℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，置室?溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、?取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3、?編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
4、?加標準品/樣本 50μl/孔到各自的微孔中，然后加配制好的受體工作液50μl/孔，用蓋板膜封板，輕輕震蕩混勻。25℃環(huán)境中反應30min。
5、?取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250μl?/孔，洗板4－5次，每次間隔15-30s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6、?加入抗體工作液50μl/孔到各自的微孔中，然后加酶標抗體50μl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。25℃環(huán)境中反應30min。
7、?取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250μl?/孔，洗板4－5次，每次間隔15-30s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
8、?顯色：每孔加入底物液A液50μl， 再加B液50μl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色10min。
9、?測定：每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定每孔OD值。
九、結(jié)果分析???
結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含青霉素成負相關(guān)
1、粗略判定
?用樣本的平均吸光度值與標準吸光度值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.310， 樣本2的吸光度值為0.820，標準液吸光度值分別是：0ppb為1.510；0.1ppb為1.320；0.3ppb為1.030；0.9ppb為0.660； 2.7ppb為0.389；8.1ppb為0.198。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb-8.1ppb； 樣本2的濃度范圍是0.3 ppb-0.9 ppb。乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中青霉素實際濃度。
2、定量分析：
所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個標準（0標準）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。
B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值
以標準品百分吸光率為縱坐標，以氨芐青霉素啉標準品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中氨芐青霉素啉實際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣品的準確、快速分析。
3、標準曲線
B/B0 (%)
???????
?
青霉素(ppb)?[μg/kg]
??????????????圖1：青霉素檢測試劑盒的回歸曲線
4、再現(xiàn)性
%CV
????青霉素(ppb)?[μg/kg]
??????圖2：青霉素檢測試劑盒的精密度
??由多個不同的實驗結(jié)果確定了精密度，圖2顯示出青霉素檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標準吸收值的變異系數(shù)（%CV）對相應青霉素濃度作曲線，可以看到全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。
十、注意事項
1、?使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標本沒有回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。
2、?在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
3、?混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復性不好的現(xiàn)象。
4、?反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
5、?不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6、?不用的微孔板放進自封袋密封；標準物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、?顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。
8、?該試劑盒最佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
【儲存】
原包裝應儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。
【有效期】
有效期12個月;生產(chǎn)日期、有效期、生產(chǎn)批號見外包裝。
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