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一、基礎(chǔ)概述

Cy5.5-MAL 是巰基特異性近紅外活性花菁熒光染料，由 Cy5.5 熒光母核 + 馬來(lái)酰亞胺（Maleimide）活性基團(tuán)組成，專門用于定點(diǎn)標(biāo)記含巰基（-SH）生物分子，是活體成像、蛋白偶聯(lián)主流試劑。

磺化Cy5.5-MAL結(jié)構(gòu)式

商品化試劑實(shí)物

1. 基礎(chǔ)參數(shù)

• 常用 CAS：1594414-90-0（磺化水溶型）、1593644-50-8（脂溶普通型）

• 外觀：深藍(lán) / 深紫色粉末，避光、防潮

• 分子量：760–1040 Da（磺化 / 非磺化版本差異大）

• 熒光光譜（核心）

• 最大激發(fā) λ??：675–685 nm

• 最大發(fā)射 λ??：695–710 nm

• 摩爾消光系數(shù)：190000–250000 M?1?cm?1

• 量子產(chǎn)率：0.20–0.27；pH4–10 熒光強(qiáng)度幾乎無(wú)變化

• 溶解性分兩類：

1. 普通 Cy5.5-MAL：溶于 DMSO、DMF、甲醇；幾乎不溶于水，標(biāo)記需加有機(jī)助溶劑

2. 磺化 sulfo-Cy5.5-MAL：雙磺酸修飾，完全水溶，適合不耐有機(jī)溶劑的蛋白 / 抗體VectorLabs

二、標(biāo)記反應(yīng)原理（馬來(lái)酰亞胺核心特性）

1. 特異性反應(yīng)靶點(diǎn)

pH 6.5–7.5 中性緩沖液下，專一結(jié)合巰基（半胱氨酸 - SH），與氨基（賴氨酸）反應(yīng)速度差 1000 倍，定點(diǎn)標(biāo)記、副反應(yīng)極少。

反應(yīng)：邁克爾加成，生成穩(wěn)定不可逆硫醚鍵，偶聯(lián)產(chǎn)物常溫 / 體內(nèi)長(zhǎng)期穩(wěn)定。

2. pH 關(guān)鍵控制（實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)）

• pH 6.5–7.5：最優(yōu)，只標(biāo)記巰基

• pH＞7.8：馬來(lái)酰亞胺快速水解失活，同時(shí)非特異性結(jié)合賴氨酸氨基，背景升高

• 禁止高 pH、長(zhǎng)時(shí)間孵育

3. 樣品預(yù)處理要點(diǎn)

蛋白 / 多肽需先用 DTT/TCEP 還原二硫鍵，再透析除去還原劑（還原劑會(huì)消耗染料），暴露出游離 - SH 才能標(biāo)記。

三、核心優(yōu)勢(shì)

1. 近紅外窗口成像：690–710 nm 落在生物組織第一近紅外窗口，血紅蛋白、水自發(fā)熒光極低，組織穿透深度 2–4 mm，適合小動(dòng)物活體腫瘤、皮下組織示蹤；

2. 光穩(wěn)定性優(yōu)于 Cy5，熒光亮度高、信噪比好；

3. 定點(diǎn)標(biāo)記：僅修飾半胱氨酸，不破壞蛋白抗原結(jié)合位點(diǎn)，優(yōu)于氨基隨機(jī)標(biāo)記（NHS 酯）；

4. 可與 Cy3、Cy7、IRDye800 多通道同時(shí)成像，光譜無(wú)重疊。

四、主要應(yīng)用場(chǎng)景

1. 活體小動(dòng)物近紅外成像（IVIS）：標(biāo)記抗體、多肽、納米藥物、外泌體，體內(nèi)腫瘤靶向示蹤、藥物分布檢測(cè)；

2. 蛋白 / 抗體定點(diǎn)熒光標(biāo)記：WB 近紅外熒光二抗、免疫熒光、流式細(xì)胞；

3. 多肽、巰基修飾 DNA/RNA、納米顆粒（金納米、脂質(zhì)體）偶聯(lián)；

4. 細(xì)胞內(nèi)巰基蛋白示蹤、生物傳感、分子探針構(gòu)建。

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