氨基比林-N-脫甲基酶（AND）試劑盒說明書
分光光度法 50管/24樣
注 意：正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義：細(xì)胞色素P450酶是一組在外源物質(zhì)代謝中，尤其是藥物和毒物，具有重要作用的酶系。AND作為P450酶系的重要一員，相當(dāng)于CYP3A4亞型，與藥物的去甲基化反應(yīng)密切相關(guān)。
測定原理：
AND催化氨基比林釋放甲醛，通過Nash比色法測定甲醛含量，即可計(jì)算出AND活性。
自備儀器和用品：
可見分光光度計(jì)、普通離心機(jī)，超速離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、1mL玻璃比色皿、蒸餾水、無水乙醇和冰。
氨基比林N去甲基化酶(AND)比色法測試盒
試劑組成和配制：
試劑一：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加50mL蒸餾水充分溶解。
試劑二：液體×1瓶，4℃保存。
試劑三：粉劑×1瓶（棕色瓶），4℃避光保存。臨用前加入2.6 mL無水乙醇，充分溶解。
試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入2.6 mL蒸餾水，充分溶解。
試劑五：粉劑×1瓶，室溫保存。臨用前加蒸餾水10mL充分溶解。
試劑六：液體×1瓶，室溫保存。
試劑七：液體×1瓶，4℃保存。
標(biāo)準(zhǔn)液：液體×1瓶，-20℃保存。臨用前取1.5 mL EP 管，加入10μl標(biāo)準(zhǔn)液，加990μl蒸餾水，混勻即為0.05 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)甲醛溶液，4℃保存。
粗酶液提?。?/span>
1、除去細(xì)胞核，線粒體等大分子物質(zhì)：稱約0.5g組織，加入1 mL試劑一，冰上充分研磨，10 000g 4℃離心30min，取上清液轉(zhuǎn)入超速離心管。
2、粗制微粒體：4℃，100 000g，離心60min，棄上清液。
3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟2的沉淀中加1mL試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g離心30min，棄上清液。
4、最終微粒體：向步驟3的沉淀中加試劑二0.5 mL，蓋緊后充分震蕩溶解，即粗酶液，待測。該待測液需當(dāng)天使用。
AND活性測定操作：
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長到412 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑二置于37℃水浴中預(yù)熱30min。
3. 對照管：取1支EP管，加入50μL粗酶液，850μL試劑二，50μL試劑三，50μL蒸餾水，混勻后置于37℃水浴保溫30min；立即加入175μL試劑五，混勻后置于冰浴中5min；取出后加入175μL試劑六，混勻后室溫靜置5min；室溫8000rpm離心5min；取新的EP管，加入500μL上清液，500μL試劑七，混勻后60℃
氨基比林N去甲基化酶(AND)比色法測試盒
水浴10min，然后取出，用冷水冷卻5min，于412nm測定光吸收，記為A對照管。
4. 測定管：取1支EP管，加入50μL粗酶液，850μL試劑二，50μL試劑三，50μL試劑四，混勻后置于37℃水浴保溫30min；立即加入175μL試劑五，混勻后置于冰浴中5min；取出后加入175μL試劑六，混勻后室溫靜置5min；室溫8000rpm離心5min；取1支新EP管，加入500μL上清液，500μL試劑七，混勻后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷卻5min，于412nm測定光吸收，記為A測定管。
5. 標(biāo)準(zhǔn)管：取1支EP管，加入500μL標(biāo)準(zhǔn)品，500μL試劑七，混勻后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷卻5min，于412nm測定光吸收，記為A標(biāo)準(zhǔn)管。
注意：每個(gè)樣品都需要做對照管。
氨基比林N去甲基化酶(AND)比色法測試盒
AND活性計(jì)算：
(1).按照蛋白濃度計(jì)算:
活性單位定義：37℃中每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生1nmol甲醛為1個(gè)酶活單位。
AND活性(nmol/min/mg prot)= C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×（A測定管－A對照管）÷A標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V樣）÷T
= 45×（A測定管－A空白管）÷A標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr
(2).按照樣本質(zhì)量計(jì)算:
活性單位定義：37℃中每分鐘每克樣品催化產(chǎn)生1nmol甲醛為1個(gè)酶活單位。
AND活性(nmol/min/g 鮮重)= C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×（A測定管－A對照管）÷A標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷(W×V樣)÷T
= 45×（A測定管－A對照管）÷A標(biāo)準(zhǔn)管÷W
C標(biāo)準(zhǔn)品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V標(biāo)準(zhǔn)品：500μL=0.0005 L；稀釋倍數(shù)：V反總÷V上清液=（50+850 +50+50+175+175）÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度mg/mL，需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒；V樣：加入粗酶液體積，50μL=0.05mL；W：樣本質(zhì)量，g ；T：反應(yīng)時(shí)間，30min。
注意事項(xiàng)：
1、粗酶液需在當(dāng)日完成測定，如需保存，則向粗酶液提取步驟3的沉淀中加0.5ml 20%的甘油，分裝后，-80℃保存；
2、試劑三和試劑四需臨用前配制，如當(dāng)天沒有用完，4℃避光保存，可用1周；
3、粗酶液可直接用于蛋白濃度測定，建議用BCA法測蛋白含量。
氨基比林N去甲基化酶(AND)比色法測試盒
關(guān)鍵字： 氨基比林N去甲基化酶(AND)比色法測試;氨基比林N去甲基化酶(AND)測試;
上海雅吉生物科技有限公司成立于2011年3月，是一家面向生命科學(xué)領(lǐng)域，提供科研類試劑、耗材、儀器、技術(shù)服務(wù)的生物企業(yè)。包括分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)等 。旗下?lián)碛?“雅吉生物”、“晶風(fēng)生物”、“彩佑實(shí)業(yè)”、“GTX” 品牌。通過公司各部門員工的共同努力在行業(yè)內(nèi)擁有較高知名度，深得新老客戶厚愛，本著“優(yōu)質(zhì)、服務(wù)、信譽(yù)”的精神，堅(jiān)持以優(yōu)良的技術(shù)、優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品、良好的信譽(yù)為國內(nèi)外廣大用戶提供優(yōu)質(zhì)生物產(chǎn)品和服務(wù)。
公司在重視產(chǎn)品質(zhì)量的同時(shí)，也建立了一套集技術(shù)支持，物流售后服務(wù)等多部門聯(lián)動(dòng)服務(wù)體系，努力把我們方便、快捷、周到的服務(wù)提供給每一個(gè)客戶，雅吉生物的試劑盒，在國內(nèi)眾多重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣泛使用，深受廣大科研人員好評(píng)，先后在權(quán)威雜志文章中被引用。
本公司鄭重承諾：質(zhì)量保證、供貨及時(shí)、服務(wù)周到。