谷氨酸合成酶（Glutamate synthase，GOGAT）試劑盒說明書

                                                                       分光光度法 50管/48樣

注    意： 正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：                           

GOGAT分布于植物中，和谷氨酰胺合成酶共同構成GS/GOGAT循環(huán)，參與氨同化的調控。

谷氨酸合成酶（Glutamate synthase，GOGAT）試劑盒測定原理：

GOGAT催化谷氨酰胺的氨基轉移到α-酮戊二酸，形成兩分子的谷氨酸；同時NADH氧化生成NAD⁺，340nm吸光度的下降速率可以反映GOGAT活性大小。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、1mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體60mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體60mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×2瓶，4℃保存；

粗酶液提取：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

谷氨酸合成酶（Glutamate synthase，GOGAT）試劑盒測定步驟：

1、 分光光度計預熱30min以上，調節(jié)波長至340nm，蒸餾水調零。

2、 樣本測定

（1）工作液的配制：在試劑二中加入25mL試劑一充分溶解混勻，置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴5min；現(xiàn)配現(xiàn)用（配好后3h內用完）；

（2）取0.1mL樣本和0.9mL工作液于1mL比色皿中，混勻，加工作液的同時開始計時，在340 nm波長下記錄20秒時的初始吸光度A1和5分20秒時的吸光度A2，計算ΔA=A1-A2。

GOGAT活性計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

GOGAT（nmol /min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V×樣Cpr) ÷T=321×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

GOGAT（nmol /min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=321×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

GOGAT（nmol /min /10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.642×ΔA

V反總：反應體系總體積，1×10^-3 L；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.1 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬。