硫氧還蛋白過氧化物酶（thioredoxin peroxidase, TPX）活性測定試劑盒說明書

                                                     分光光度法  50管/48樣

注    意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

TPX屬于過氧化物酶家族，在體內主要通過還原過氧化氫和一些氫過氧化物來實現(xiàn)抗氧化作用，功能與GPX類似，也是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)關鍵酶之一。TPX普遍存在于各種生物體內，如酵母、植物、動物、原生動物、寄生蟲、細菌和古細菌，在進化上高度保守。TPX與細胞增殖、分化、細胞凋亡及腫瘤發(fā)生調控密切相關。TPX的主要功能包括細胞脫毒、抗氧化和調節(jié)由過氧化氫介導的信號轉導和免疫反應。

硫氧還蛋白過氧化物酶（thioredoxin peroxidase, TPX）活性測定試劑盒測定原理：

TPX催化H₂O₂氧化二硫蘇糖醇（DTT），H₂O₂的吸收波長為240nm，通過測定240nm吸光度的下降速率，即可計算出TPX活性。

自備儀器和用品:

紫外分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、可調節(jié)移液器、1mL石英比色皿和蒸餾水

試劑組成和配制:

試劑一：液體50mL×1瓶，室溫保存。

試劑二：液體50mL×1瓶，- 20℃保存。

試劑三：液體5mL×1瓶，4℃。

粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。

2. 細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

3. 血清等液體：直接測定。

TPX測定操作：

1. 分光光度計預熱30min，調節(jié)波長到240 nm，蒸餾水調零。

2.試劑二置于25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動物）水浴預熱30 min。

3.取1mL石英比色皿，加入20 μ L上清液，900 μ L試劑二，80 μ L試劑三，迅速混勻后于240 nm測定10 s和130 s吸光度，記為A1和A2。

TPX活性計算公式：

(1) 按蛋白濃度計算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol H₂O₂降解為1個酶活單位。

TPX活性（nmol/min /mg prot）=(A1－A2)÷ε÷d×V反總÷（Cpr×V樣）÷T

=573×(A1－A2)÷Cpr

(2) 按樣本質量計算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每克樣本每分鐘催化1nmol H₂O₂降解為1個酶活單位。

TPX活性（nmol/min/g鮮重）=(A1－A2)÷ε÷d×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=573×(A1－A2)÷W

（3）按細胞數(shù)量計算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每10⁴個細胞每分鐘催化1nmol H₂O₂降解為1個酶活單位。

TPX活性（nmol/min/10⁴ cell）=(A1－A2)÷ε÷d×V反總÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

=573×(A1－A2)÷細胞數(shù)量

（4）按液體體積計算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每毫升液體每分鐘催化1nmol H₂O₂降解為1個酶活單位。

TPX活性（nmol/min /mL）=(A1－A2)÷ε÷d×V反總÷V樣÷T

=573×(A1－A2)

ε：H₂O₂的摩爾消光系數(shù)，43600 L/mol/cm=0.0436 L/μmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應體系總體積（L），1000 μ L=0.001 L；Cpr：上清液蛋白質濃度（mg/mL）；V樣：加入反應體系中上清液體積（mL），20 μ L=0.02 mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；W，