氧化型谷胱甘肽含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)
分光光度法50管/48樣
注 意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
氧化型谷胱甘肽含量測(cè)定試劑盒測(cè)定意義：
GSH/GSSG是細(xì)胞內(nèi)最重要的氧化還原對(duì)之一。因此，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值，能夠很好地反映細(xì)胞所處的氧化還原狀態(tài)，也是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)的主要指標(biāo)之一。
測(cè)定原理：
利用2-VP法測(cè)GSSG含量。
自備儀器和用品：
可見(jiàn)分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、1mL玻璃比色皿和蒸餾水。
試劑組成和配置：
試劑一：液體50mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：液體300μL×1支，4℃保存。
試劑三：液體50mL×1瓶，4℃保存。
試劑四：液體6mL×1瓶，4℃保存。
試劑五： 液體30μL×1瓶，-20℃保存。臨用前加入0.6 mL試劑三稀釋?zhuān)?/span>4℃保存。
試劑六：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入40 mL試劑三溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用。
粗酶液提取：
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清液（如上清不清澈，再離心3min）待測(cè)。
2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；8000g 4℃離心10min，取上清液（如上清不清澈，再離心3min）的蒸餾水混勻待測(cè)。
3. 血清等液體：直接測(cè)定。
氧化型谷胱甘肽含量測(cè)定試劑盒測(cè)定操作:
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到412 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑三置于25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動(dòng)物）水浴中保溫30min。
3. 測(cè)定管：取1 mL EP管，加入100 μ L上清液，5μ L試劑二，蓋緊后混勻，置于37℃水浴30min；依次加入100 μ L試劑四，10 μ L試劑五，700 μ L試劑六，迅速混勻后，立即測(cè)定30 s和150 s光吸收A1和A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。
GSSG含量計(jì)算公式:
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y=0.0276x-0.0011；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL），y為吸光值(ΔA)。
2、 按蛋白濃度計(jì)算
GSSG（nmol/mg prot）=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V樣÷(V樣×Cpr)
=36.23×(ΔA+0.0011)÷Cpr
3、按樣本鮮重計(jì)算
GSSG（nmol /g 鮮重）=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V樣÷(V樣÷V樣總×W)
=36.23×(ΔA+0.0011)÷W
4、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
GSSG（nmol/104 cell）=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V樣÷(V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量)
=36.23×(ΔA+0.0011)÷細(xì)胞數(shù)量
5、按照液體體積計(jì)算
GSSG（nmol/mL）=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V樣÷V樣
=36.23×(ΔA+0.0011)
V樣：反應(yīng)中加入樣本體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積， 1mL；W：樣品質(zhì)量，g，Cpr：樣本蛋白濃度（mg/mL）
氧化型谷胱甘肽含量測(cè)定試劑盒注意事項(xiàng)：
1. 提取過(guò)程中去掉蛋白質(zhì)，所以提取液不能用于測(cè)定蛋白含量。
2. 臨用前配制的試劑配好后4℃保存，2天內(nèi)使用完畢。
3. 最低檢出限為0.1μmol/L。
4. 反應(yīng)溫度.嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，為保證重復(fù)性，應(yīng)在25℃下進(jìn)行反應(yīng)。
5. 反應(yīng)時(shí)間需精確控制，否則會(huì)影響反應(yīng)速率計(jì)算，產(chǎn)生較大誤差。
6. 樣品中的GSSG濃度盡可能低一些，否則反應(yīng)速率太大，沒(méi)法控制，所以稀釋倍數(shù)要盡量大些。
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