129030-36-0；Digoxigenin-11-dUTP

Digoxigenin-11-dUTP 是用于 DNA 而非 RNA 的非放射性標(biāo)記。它是一種關(guān)鍵的分子生物學(xué)試劑，用于制備地高辛標(biāo)記的DNA探針。

核心功能：DNA探針的標(biāo)記

Digoxigenin-11-dUTP 是一種修飾的脫氧核苷酸：

• dUTP部分：是合成DNA的基本構(gòu)建單元之一（脫氧尿苷三磷酸）。

• Digoxigenin部分：作為半抗原標(biāo)記物。

• “11-”連接臂：將地高辛連接到堿基上，以最小化對DNA聚合酶活性的干擾。

主要應(yīng)用領(lǐng)域

由于其標(biāo)記對象是DNA，它被廣泛應(yīng)用于所有需要DNA探針的檢測技術(shù)中：

1. 原位雜交（特別是DNA原位雜交）

• 檢測染色體/DNA序列：用于定位基因組中的特定DNA序列，如基因拷貝數(shù)變異、染色體上的基因定位（基因作圖）、病毒DNA在細(xì)胞或組織中的檢測等。

• 過程：通過酶促反應(yīng)將Digoxigenin-11-dUTP摻入DNA探針。該探針與經(jīng)變性處理的樣品DNA雜交后，用抗地高辛抗體進(jìn)行免疫檢測。

2. Southern Blot

• 用于檢測特定DNA序列的存在、大小和拷貝數(shù)。

• 用地高辛標(biāo)記的DNA探針與固定在膜上的基因組DNA進(jìn)行雜交，通過化學(xué)發(fā)光或顯色法檢測。這是放射性同位素標(biāo)記的常用替代方案。

3. DNA微陣列/CGH（比較基因組雜交）

• 用于基因分型或檢測DNA拷貝數(shù)變化。樣品DNA（如腫瘤基因組DNA）可以用Digoxigenin-11-dUTP標(biāo)記，然后與芯片上的探針雜交。

4. 熒光原位雜交

• 雖然FISH常用直接熒光標(biāo)記，但地高辛標(biāo)記的探針與偶聯(lián)了熒光染料的抗地高辛抗體結(jié)合，也是一種有效的間接FISH策略，尤其適用于信號擴(kuò)增或多色檢測。

工作原理（如何摻入DNA）

與UTP用于RNA聚合酶不同，dUTP需要被DNA聚合酶識別和利用。主要摻入方法有：

• 缺口平移：傳統(tǒng)方法，使用DNase I和DNA聚合酶I在DNA鏈上制造缺口并替換核苷酸，摻入標(biāo)記的dUTP。

• 隨機(jī)引物標(biāo)記：更常用的高效方法。使用隨機(jī)六聚體引物和Klenow片段（DNA聚合酶I的大片段），以變性DNA為模板，合成含有標(biāo)記dUTP的新鏈。

• PCR標(biāo)記：最便捷的方法。在PCR反應(yīng)體系中，將一定比例的普通dTTP替換為Digoxigenin-11-dUTP，Taq DNA聚合酶會將其摻入到擴(kuò)增產(chǎn)物中，從而直接得到標(biāo)記的DNA探針。

• 末端標(biāo)記：使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 在DNA片段的3‘端添加一個或多個標(biāo)記的dUTP，適用于標(biāo)記寡核苷酸探針。

檢測方式

與Digoxigenin-11-UTP完全相同：

1. 探針與靶標(biāo)DNA雜交。

2. 用抗地高辛抗體（偶聯(lián)堿性磷酸酶AP或辣根過氧化物酶HRP）結(jié)合。

3. 通過酶促底物產(chǎn)生：

• 化學(xué)發(fā)光信號（如CSPD for AP；ECL for HRP）：用于印跡雜交，靈敏度極高。

• 顯色信號（如NBT/BCIP for AP；DAB for HRP）：用于原位雜交或印跡雜交，可直接肉眼或光學(xué)顯微鏡觀察。

主要優(yōu)勢

• 安全性：替代放射性32P-dCTP。

• 高穩(wěn)定性：探針可長期保存。

• 高靈敏度與低背景：免疫檢測系統(tǒng)特異性強(qiáng)。

• 多功能性：適用于從膜雜交到原位檢測的所有DNA分析技術(shù)。

總結(jié)與對比 Digoxigenin-11-UTP

核心結(jié)論：
Digoxigenin-11-dUTP 是專門用于將地高辛半抗原標(biāo)記摻入到DNA分子中的底物。它是制備非放射性DNA探針的核心試劑，廣泛應(yīng)用于檢測和定位特定DNA序列的各種分子生物學(xué)技術(shù)中，是基因組研究、病理診斷和基礎(chǔ)研究的重要工具。選擇使用dUTP還是UTP，完全取決于您需要標(biāo)記和檢測的對象是DNA還是RNA。