檢測目的

用于定量檢測小鼠血清、血漿、細胞上清液等樣本中IL-4的濃度。

實驗原理（雙抗體夾心法）

包被抗體：抗小鼠IL-4單克隆抗體預包被于微孔板。

樣本結合：加入樣本，樣本中IL-4與固相抗體結合。

檢測抗體：加入HRP標記的抗小鼠IL-4二抗，形成“抗體-抗原-酶標抗體”復合物。

顯色反應：

加入底物TMB（3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺），HRP催化TMB生成藍色產物。

加入終止液（酸性溶液）后轉為黃色。

結果讀取：在450nm波長下測定吸光度（OD值），OD值與IL-4濃度正相關。

試劑盒組成（示例）

| 組件 | 規(guī)格（96孔） | 保存條件 |

| 預包被微孔板 | 12條×8孔 | 2–8°C |

| IL-4標準品 | 凍干粉/溶液 | -20°C |

| HRP標記檢測抗體 | 1瓶（120μL） | 2–8°C |

| TMB底物溶液 | 1瓶（10mL） | 避光2–8°C |

| 終止液（2M H?SO?） | 1瓶（10mL） | 2–8°C |

| 濃縮洗滌緩沖液 | 1瓶（50mL） | 2–8°C（按需稀釋） |

| 封板膜 | 2張 | 室溫 |

注：實際組分請以廠商最新說明書為準，濃縮洗滌液需按說明書比例稀釋（如1:25）。

樣本要求

血清/血漿：避免溶血，離心去除顆粒物，-80°C長期保存。

細胞上清液：離心去除細胞碎片，避免反復凍融。

操作步驟

標準品稀釋：用標準品稀釋液配制系列濃度梯度（如0–500 pg/mL）。

加樣：

標準孔：50μL 標準品

樣本孔：50μL 樣本

孵育：37°C孵育1–2小時。

洗滌：甩干孔內液體，用洗滌液注滿微孔，靜置30秒后棄去，重復5次。

加酶標抗體：每孔加100μL HRP標記抗體，37°C孵育1小時。

洗滌：同上，重復5次。

顯色：每孔加90μL TMB，避光反應15–30分鐘。

終止：每孔加50μL終止液，顏色由藍轉黃。

檢測：30分鐘內于450nm讀取OD值（校正波長：570nm或630nm）。

結果計算

繪制標準曲線：以標準品濃度（log）為橫坐標，OD值（log）為縱坐標。

根據(jù)樣本OD值，通過曲線方程計算IL-4濃度（單位：pg/mL）。

注意事項

試劑平衡：所有組分使用前室溫平衡30分鐘。

洗滌徹底：避免假陽性，每次洗滌后拍干孔板。

顯色控制：TMB反應時間需優(yōu)化，避免過度顯色。

安全防護：終止液含強酸，需穿戴手套操作。

參考范圍與性能參數(shù)

靈敏度：通常<10 pg/mL。

精密度：批內CV <10%，批間CV <15%。

特異性：不與小鼠IL-2、IL-6等其他細胞因子交叉反應。

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