技術(shù)原理

基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）探針?lè)ǎ?/span>

探針設(shè)計(jì)：5'端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)（如FAM），3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)，通過(guò)Taq酶5'→3'外切酶活性切割探針，釋放熒光信號(hào)。

定量分析：通過(guò)檢測(cè)擴(kuò)增過(guò)程中熒光信號(hào)強(qiáng)度（Ct值），實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)RNA/DNA的定量或定性檢測(cè)。

高特異性：引物及探針針對(duì)夏枯草高度保守序列設(shè)計(jì)，避免交叉反應(yīng)。

試劑盒組成

| 成分 | 規(guī)格 | 功能 |

| 探針?lè)╭RT-PCR緩沖液 | 500μL | 提供反應(yīng)體系基礎(chǔ)環(huán)境 |

| 探針?lè)╭RT-PCR酶混合液 | 100μL | 含逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶等 |

| 熒光PCR專(zhuān)用模板稀釋液 | 1 mL | 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋 |

| 夏枯草引物混合液 | 100μL | 特異性擴(kuò)增目標(biāo)序列 |

| 夏枯草qRT-PCR探針 | 50μL | 熒光信號(hào)釋放 |

| 陽(yáng)性對(duì)照（1×10?拷貝/μL） | 50μL | 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備 |

| 說(shuō)明書(shū) | 1份 | 操作指南 |

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備（6個(gè)梯度稀釋?zhuān)?/span>

使用陽(yáng)性對(duì)照按10倍梯度稀釋?zhuān)?0?~102拷貝/μL），獨(dú)立操作避免污染。

2. 樣本RNA提取

建議設(shè)置陰性對(duì)照（NC）和陽(yáng)性對(duì)照（PC），使用兼容RNA提取試劑盒純化。

3. qRT-PCR反應(yīng)體系（20μL）

| 組分 | 樣品管 | 陰性對(duì)照 | 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)管 |

| 緩沖液 | 10μL | 10μL | 10μL |

| 酶混合液 | 2μL | 2μL | 2μL |

| 探針 | 1μL | 1μL | 1μL |

| 引物混合液 | 2μL | 2μL | 2μL |

| 模板RNA | 5μL | - | - |

| 超純水 | - | 5μL | - |

| 標(biāo)準(zhǔn)品 | - | - | 5μL |

4. 反應(yīng)程序

| 步驟 | 溫度 | 時(shí)間 |

| 逆轉(zhuǎn)錄 | 50℃ | 30 min |

| 預(yù)變性 | 94℃ | 10 min |

| 擴(kuò)增（40循環(huán)） | 94℃ 15 sec → 60℃ 1 min（采集熒光） |

數(shù)據(jù)分析

定量檢測(cè)：以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)log值為橫軸，Ct值為縱軸，計(jì)算樣本濃度。

定性檢測(cè)：

陽(yáng)性：Ct ≤ 35，典型擴(kuò)增曲線(xiàn)；

陰性：Ct ≥ 40；

可疑（35<Ct<40）：需重復(fù)檢測(cè)。

注意事項(xiàng)

防污染：分區(qū)操作（樣本處理、試劑配制、擴(kuò)增），使用帶濾芯槍頭。

儲(chǔ)存：-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融。

質(zhì)量控制：每次實(shí)驗(yàn)需包含陰/陽(yáng)性對(duì)照。

禁用范圍：僅限科研，不可用于臨床診斷。

公司正在出售的產(chǎn)品