檢測(cè)原理
基于TaqMan探針法實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，針對(duì)車前子基因保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物及探針。通過熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增進(jìn)程，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)定性/定量分析，特異性強(qiáng)，靈敏度達(dá)103拷貝/μL。
產(chǎn)品名稱 | 車前子探針法PCR鑒定試劑盒 | 英文名稱 | Semen Plantaginis Probe-based PCR Identification Kit |
產(chǎn)品規(guī)格 | 50T | 產(chǎn)品分類 | 熒光定量PCR |
檢測(cè)類型 | PCR檢測(cè) | 產(chǎn)品貨號(hào) | PR5171 |
試劑盒組分
| 成分 | 規(guī)格 | 功能 |
| qPCR緩沖液 | 500μL/管 | 提供反應(yīng)體系基礎(chǔ)環(huán)境 |
| 酶混合液 | 50μL/管 | 含熱啟動(dòng)Taq酶、逆轉(zhuǎn)錄酶|
| 引物-探針干粉 | 50T | 特異性擴(kuò)增目標(biāo)序列 |
| 陽性對(duì)照（人工DNA片段）| 50μL（10?拷貝/μL）| 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及質(zhì)控 |
| 陰性對(duì)照（超純水） | 50μL | 污染監(jiān)測(cè) |
實(shí)驗(yàn)步驟
樣本處理：
使用商品化DNA提取試劑盒（推薦Hypure病毒基因組DNA提取試劑盒），避免交叉污染。
樣本保存：短期-20℃，長(zhǎng)期-70℃（避免反復(fù)凍融）。
標(biāo)準(zhǔn)曲線制備（定量檢測(cè)需6個(gè)稀釋梯度）：
陽性對(duì)照10倍梯度稀釋（10?~102拷貝/μL），每管加入5μL至反應(yīng)體系。
反應(yīng)體系配制（20μL/管）：
| 組分 | 體積 |
| qPCR緩沖液 | 10μL |
| 酶混合液 | 2μL |
| 引物-探針混合液 | 2μL |
| 模板DNA | 5μL |
PCR擴(kuò)增程序：
逆轉(zhuǎn)錄：50℃ 30 min（RNA樣本需此步驟）。
預(yù)變性：94℃ 10 min。
擴(kuò)增循環(huán)（40次）：94℃ 15 sec → 60℃ 1 min（采集FAM通道信號(hào)）。
結(jié)果判讀
定量分析：以Ct值為縱軸，標(biāo)準(zhǔn)曲線log值為橫軸，計(jì)算樣本濃度。
定性分析：
陽性：Ct值≤35，且擴(kuò)增曲線呈S型。
陰性：Ct值≥40或無擴(kuò)增曲線。
灰區(qū)（35<Ct<40）：需重復(fù)檢測(cè)。
注意事項(xiàng)
防污染：分區(qū)操作（試劑配制、樣本處理、擴(kuò)增區(qū)），使用濾芯吸頭及紫外消毒。
質(zhì)控要求：
陰性對(duì)照Ct≥40，陽性對(duì)照Ct≤35。
若陽性質(zhì)控異常，需排查試劑或儀器問題。
局限性：
基因突變可能導(dǎo)致假陰性；交叉污染或模板降解影響結(jié)果準(zhǔn)確性。
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關(guān)鍵字： 車前子;探針法;PCR鑒定試劑盒;
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