適用樣本類型及前處理要點(diǎn)
樣本類別 具體樣本示例 前處理關(guān)鍵步驟
臨床樣本 病馬皮膚痘疹滲出液、鼻腔分泌物、血液（EDTA抗凝） ① 皮膚滲出液：直接取50μL加DNA裂解液，100℃加熱10min
② 血液：3000rpm離心5min取沉淀，CTAB法提取DNA
組織樣本 病變皮膚組織、淋巴結(jié)、肺臟勻漿 液氮研磨后加1mL生理鹽水制成懸液，13000rpm離心3min取沉淀，用病毒DNAout試劑裂解
環(huán)境樣本 廄舍表面拭子、飼料殘留、飲水 拭子用2mL生理鹽水洗脫，8000rpm離心3min取上清，二次離心（13000rpm，5min）后沉淀裂解
產(chǎn)品名稱 | 馬痘病毒染料法熒光定量PCR試劑盒 | 英文名稱 | Horsepox Virus Dye-based qPCR Kit |
產(chǎn)品規(guī)格 | 50T | 產(chǎn)品分類 | 熒光定量PCR |
檢測(cè)類型 | PCR檢測(cè) | 產(chǎn)品貨號(hào) | PR3110 |
試劑盒組成
組分 規(guī)格 用途
2×qPCR MagicMix（棕色管） 500μL 含熱啟動(dòng)DNA聚合酶、SYBR Green染料、dNTP
馬痘病毒引物混合液（白蓋） 100μL (10μM) 特異性擴(kuò)增靶基因保守區(qū)
陽性對(duì)照（紅蓋） 50μL (1×10?拷貝/μL) 驗(yàn)證反應(yīng)有效性（無傳染性DNA片段）
熒光PCR專用模板稀釋液（黃蓋） 1mL 稀釋陽性對(duì)照及樣本模板
DNA病毒裂解液（試用裝） 9mL（15次用量） 快速裂解病毒釋放DNA
操作流程
1. 樣本DNA提?。颖局苽鋮^(qū)）
液體樣本（如滲出液、血液）：取100μL加50μL DNA裂解液，100℃加熱10min，13000rpm離心3min，取上清5μL作為模板。
組織/拭子樣本：按“樣本類型表”處理后，用試劑盒配套裂解液或柱提法提取DNA，確保A260/A280比值在1.8-2.0。
2. 陽性對(duì)照稀釋（獨(dú)立區(qū)域，避免污染）
標(biāo)記6個(gè)離心管（2-7號(hào)），各加45μL模板稀釋液；
7號(hào)管加5μL陽性對(duì)照（1×10?拷貝/μL），梯度稀釋至2號(hào)管（1×103拷貝/μL），形成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3. 反應(yīng)體系配制（20μL/管）
2×qPCR MagicMix 10μL
馬痘病毒引物混合液 2μL
模板DNA（樣本/對(duì)照） 5μL
無酶水 3μL
陰性對(duì)照：用無酶水替代模板；
陽性對(duì)照：取各稀釋度標(biāo)準(zhǔn)品5μL。
4. 擴(kuò)增程序
步驟 溫度 時(shí)間 循環(huán)數(shù)
預(yù)變性 95℃ 10分鐘 1次
變性 95℃ 15秒 40次
退火延伸（采集熒光） 60℃ 1分鐘 40次
溶解曲線分析 65℃→95℃ 每0.5℃停留5秒 1次
結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)
陽性：Ct≤35，溶解曲線單一峰值（Tm=86±1℃）；
可疑：35<Ct<38，需重新提取DNA驗(yàn)證；
陰性：Ct≥38或無擴(kuò)增（陰性對(duì)照無Ct值）。
注意事項(xiàng)
防污染：陽性對(duì)照稀釋需在獨(dú)立區(qū)域操作，使用帶濾芯吸頭，PCR產(chǎn)物區(qū)與試劑準(zhǔn)備區(qū)分開；
樣本保存：新鮮樣本4℃保存不超過24小時(shí)，-20℃可保存1周，避免反復(fù)凍融；
儀器兼容性：適用于ABI、Bio-Rad、LightCycler等熒光定量PCR儀，ABI 7500等需添加ROX參比染料。
公司正在出售的產(chǎn)品
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,羊血吸蟲探針法熒光定量PCR試劑盒 | 大鼠補(bǔ)體蛋白4ELISA試劑盒 |
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關(guān)鍵字： 馬痘病毒;染料法熒光定量;PCR試劑盒;
派瑞曼pyram?是上海博湖生物科技有限公司（Shanghai Bohu Biological Technology Co., Ltd.，China）的產(chǎn)品品牌。
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