預期用途

本試劑盒采用實時熒光定量PCR技術（染料法：SYBR Green I），結(jié)合特異性引物，用于定性及定量檢測人血清或血漿樣本中的乙型肝炎病毒（HBV）DNA。適用于HBV感染的輔助診斷、治療監(jiān)測及療效評估。本試劑盒可檢測已知的HBV A-H基因型。

檢測原理

核酸提取： 從血清或血漿樣本中提取病毒DNA。

PCR擴增： 使用針對HBV基因組保守區(qū)域（如S區(qū)或C區(qū)）設計的高特異性引物進行擴增。

熒光檢測： PCR反應體系中加入SYBR Green I熒光染料。該染料能特異性地嵌入雙鏈DNA(dsDNA)小溝中，在激發(fā)光照射下發(fā)出熒光。隨著PCR循環(huán)的進行，擴增產(chǎn)物量（dsDNA）不斷增加，熒光信號強度也隨之增強。

定量分析： 儀器實時監(jiān)測每個反應管內(nèi)的熒光信號變化。通過檢測達到熒光閾值（Threshold）所需的循環(huán)數(shù)（Ct值），結(jié)合標準品繪制的標準曲線，即可計算出樣本中HBV DNA的拷貝數(shù)或國際單位（IU/mL）。

主要組成成分

| 組分名稱 | 規(guī)格 (48測試) | 規(guī)格 (96測試) | 主要成分及作用 |

| qPCR預混液 (2X) | 1.0 mL x 1管 | 1.0 mL x 2管 | 熱啟動Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl?、SYBR Green I熒光染料、穩(wěn)定劑、優(yōu)化緩沖液。 |

| HBV特異性引物混合液 (10X) | 120 μL x 1管 | 120 μL x 2管 | 針對HBV保守區(qū)域設計的特異性上游和下游引物。 |

| HBV DNA陽性定量標準品 | 5管 | 5管 | 含已知濃度（如 10^2, 10^3, 10^4, 10^5, 10^6 IU/mL 或 copies/mL）的HBV DNA片段。 |

| 陰性對照 (NTC) | 1管 (1 mL) | 1管 (1 mL) | 無核酸酶水或陰性血清基質(zhì)。 |

| 無核酸酶水 | 1 mL x 1管 | 1 mL x 2管 | 用于稀釋和復溶。 |

| (可選) 內(nèi)標 (IC) 及引物 | - | - | 用于監(jiān)控提取和擴增過程，防止假陰性（部分試劑盒包含）。 |

| (可選) UDG/dUTP 防污染系統(tǒng) | - | - | 含dUTP和尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)，防止擴增產(chǎn)物污染（部分試劑盒包含）。 |

儲存條件及有效期：

-20℃ ± 5℃ 避光保存。避免反復凍融（建議分裝）。

有效期：12個月（自生產(chǎn)日期起）。開封后根據(jù)組分不同，按說明書要求保存（通常預混液和引物短期可4℃保存，長期需-20℃；標準品和對照品建議-20℃保存）。

樣本要求

樣本類型： 人血清或乙二胺四乙酸（EDTA）、枸櫞酸鈉抗凝的血漿。避免使用肝素抗凝血漿（肝素抑制PCR反應）。

采集與處理： 無菌采集靜脈血，按常規(guī)方法分離血清或血漿。避免溶血、脂血。

儲存： 新鮮樣本建議盡快檢測。如不能立即檢測，2-8℃可保存不超過72小時；長期保存需置于-20℃或-70℃，避免反復凍融。

運輸： 冰袋或干冰運輸。

檢驗方法

樣本處理與核酸提取：

嚴格按照所選用病毒核酸提取試劑盒的操作說明書進行。使用100-200μL血清/血漿樣本進行提取。

洗脫/溶解體積：根據(jù)提取試劑盒要求或后續(xù)PCR反應體系決定（常用30-60μL無核酸酶水或洗脫液）。

提取的DNA應立即進行PCR檢測，或暫存于-20℃（短期）/ -70℃（長期）。

試劑準備（冰上操作）：

將所需組分（qPCR預混液 (2X)、HBV引物混合液 (10X)、陽性標準品、陰性對照、無核酸酶水）從冰箱取出，完全融化并混勻，短暫離心備用。

陽性標準品梯度稀釋：按照說明書要求，用陰性對照或無核酸酶水對陽性定量標準品進行系列稀釋（至少5個梯度），制備標準曲線。

PCR反應體系配制（以單反應20μL體系為例）：

| 組分 | 體積 (μL) |

| qPCR預混液 (2X) | 10.0 |

| HBV引物混合液 (10X) | 2.0 |

| 無核酸酶水 | 3.0 |

| 模板DNA | 5.0 |

| 總體積 | 20.0 |

輕柔混勻反應液，短暫離心。

每個樣本/對照均需做雙孔或三孔重復。

加樣：

將配制好的反應液分裝至PCR反應管/板孔中（每孔15μL不含模板的反應液）。

分別加入對應模板：

待測樣本DNA：5μL

陰性對照 (NTC)：5μL

各濃度梯度陽性標準品：5μL

(如有) 內(nèi)標對照：按說明加入

PCR擴增與檢測：

蓋好管蓋/封板膜，將反應管/板置于熒光定量PCR儀中。

設置反應程序（示例，需根據(jù)具體試劑盒優(yōu)化）：

預變性： 95℃, 3-5分鐘 (激活熱啟動酶)

循環(huán)擴增 (40-45循環(huán))：

變性: 95℃, 10-15秒

退火/延伸：60℃, 30-60秒 (在此階段采集SYBR Green熒光信號)

(可選) 熔解曲線分析：

95℃, 15秒

60℃, 1分鐘

緩慢升溫至95℃ (如0.3-0.5℃/秒)，連續(xù)采集熒光信號。

結(jié)果判讀：

有效性判定：

陰性對照 (NTC)： Ct值應為“Undetected”或大于設定的無效值（如40）。

陽性標準品： 各濃度梯度應能有效擴增，Ct值與濃度呈良好線性關系（R2 > 0.98）。標準曲線斜率為-3.3左右。

(如有) 內(nèi)標 (IC)： 所有樣本（包括陽性和陰性）的內(nèi)標通道均應擴增良好，表明提取和擴增過程有效。若樣本HBV通道陰性但內(nèi)標也陰性，則為無效，需重檢。

樣本結(jié)果判定：

陽性： 樣本在HBV檢測通道出現(xiàn)典型的S型擴增曲線，且Ct值小于設定的陽性判斷值（例如 ≤ 38或40，具體值由試劑盒性能驗證確定）。熔解曲線分析顯示單特異的熔解峰Tm值（應與標準品主峰Tm值一致），用于排除非特異性擴增和引物二聚體。

陰性： 樣本在HBV檢測通道未出現(xiàn)擴增曲線或Ct值大于陽性判斷值。熔解曲線無特異性峰或Tm值不符。

定量： 根據(jù)樣本的Ct值，利用標準曲線（Log濃度 vs Ct值）計算出樣本中HBV DNA的濃度（單位：IU/mL 或 copies/mL）。報告時應注明定量下限（LLOQ）和檢測下限（LOD）。

公司正在出售的產(chǎn)品