匙形古柏線蟲染料法熒光定量PCR試劑盒
商品屬性
產(chǎn)品名稱 | 匙形古柏線蟲染料法熒光定量PCR試劑盒 | 英文名稱 | Cooperia oncophora Dye-based qPCR Kit |
規(guī)格 | 50T | 貨號 | PR4247 |
產(chǎn)品用途
本試劑盒基于SYBR Green I熒光染料法，利用實時熒光定量PCR (qPCR) 技術，特異性檢測牛羊糞便、環(huán)境樣本或蟲體樣本中的匙形古柏線蟲 (Cooperia oncophora) DNA。適用于：
牧場或養(yǎng)殖場寄生蟲感染調(diào)查與監(jiān)測
驅蟲藥藥效評價
流行病學研究
臨床獸醫(yī)診斷輔助（需結合臨床癥狀和其他檢查）
檢測原理
DNA提取： 需使用商業(yè)化的糞便基因組DNA提取試劑盒或相應方法從樣本中提取總DNA（注：本試劑盒通常不包含DNA提取組分）。
特異性擴增： 試劑盒內(nèi)包含針對匙形古柏線蟲特異性基因靶標（通常是ITS-1, ITS-2, 18S rRNA或cox1基因的保守區(qū)域）設計的引物對。這些引物在PCR反應中特異性結合目標DNA序列。
熒光信號檢測： PCR反應體系中包含SYBR Green I 熒光染料。該染料非特異性地嵌入雙鏈DNA (dsDNA) 的小溝中。隨著PCR擴增的進行，dsDNA產(chǎn)物（包括特異性目標產(chǎn)物和非特異性產(chǎn)物/引物二聚體）不斷累積，SYBR Green I 嵌入后發(fā)出的熒光信號強度也隨之增強。
實時定量與熔解曲線分析： 實時熒光定量PCR儀在每一個循環(huán)的延伸步驟后檢測熒光信號強度。通過標準曲線或閾值循環(huán)數(shù) (Ct值) 對目標DNA進行相對定量。反應結束后進行熔解曲線分析 (Melting Curve Analysis)：通過緩慢升高溫度使dsDNA解鏈，監(jiān)測熒光信號隨溫度的變化。特異性PCR產(chǎn)物具有特定的熔解溫度 (Tm)，而引物二聚體等非特異性產(chǎn)物通常具有不同的（較低的）Tm值，據(jù)此可區(qū)分特異性擴增與非特異性擴增。
試劑盒組分 (以96次反應為例)
| 組分名稱 | 體積/數(shù)量 | 儲存條件 |
| 2X SYBR Green qPCR Master Mix | 1.25 mL x 2 管 | -20℃ |
| 包含： 高效熱啟動DNA聚合酶、dNTPs、優(yōu)化緩沖液、SYBR Green I染料、穩(wěn)定劑等 | | |
| 匙形古柏線蟲特異性引物混合液 (Coop Primer Mix) | 150 μL x 1 管 | -20℃ |
| 包含： 針對匙形古柏線蟲靶基因的特異性正向和反向引物 (工作濃度) | | |
| Nuclease-Free Water | 1.5 mL x 1 管 | 室溫/-20℃ |
| 陽性對照 (Positive Control, PC) | 100 μL x 1 管 | -20℃ |
| 包含： 含有匙形古柏線蟲靶基因片段的重組質粒或人工合成DNA片段 | | |
| 陰性對照 (Negative Control, NC) | 100 μL x 1 管 | -20℃ |
| 通常為： Nuclease-Free Water 或確定無靶DNA的樣本提取液 | | |
用戶需自備試劑與設備
樣本DNA提取試劑盒 (用于糞便/組織/環(huán)境樣本的DNA提取)
無核酸酶 (Nuclease-Free) 的PCR反應管或96孔板
光學平蓋或封板膜
移液器及配套無菌、無核酸酶槍頭
微型離心機
實時熒光定量PCR儀 (兼容SYBR Green檢測通道，如Applied Biosystems, Bio-Rad, Roche LightCycler等主流型號)
冰盒
樣本判讀
樣本出現(xiàn)典型S型擴增曲線且Ct值 ≤ 設定的閾值 (如35或38)，同時其熔解曲線峰值Tm值與陽性對照一致，可判為匙形古柏線蟲DNA陽性。
若Ct值在閾值附近或熔解曲線不典型（如出現(xiàn)雙峰、Tm值偏移），需謹慎判讀，可能需重復實驗或進一步驗證（如測序）。
Ct值 > 閾值或無明顯擴增曲線，判為陰性。
定量 (可選)： 如需相對定量，需在每次實驗中同時運行含有已知拷貝數(shù)陽性模板（如梯度稀釋的PC）的標準曲線。根據(jù)標準曲線計算樣本中的目標基因相對量。
預期結果與熔解曲線
陽性對照 (PC)： Ct值通常較低且穩(wěn)定 (具體范圍取決于起始拷貝數(shù))。熔解曲線在特定Tm值 (例如：85.0℃ ± 0.5℃，此為示例，實際值由引物決定) 處出現(xiàn)單一的尖銳主峰。
陰性對照 (NC)： 無擴增曲線 (Ct值無或>38/40)，熔解曲線無峰或出現(xiàn)寬泛低矮的非特異峰(Tm通常較低)。
陽性樣本： 擴增曲線及Tm峰形與PC一致。
陰性樣本： 擴增曲線及Tm峰形與NC一致。
注意事項
嚴格分區(qū)操作：試劑配制區(qū)、樣品處理區(qū)、PCR擴增區(qū)需物理分隔，防止污染。
良好的實驗室操作規(guī)范(GLP)：勤換手套，使用無核酸酶耗材，避免氣溶膠污染。
試劑解凍后充分混勻，短暫離心。避免反復凍融，建議分裝。
模板DNA避免含有高濃度抑制劑。如有必要，可對提取的DNA進行稀釋或純化。
熔解曲線分析是區(qū)分特異性產(chǎn)物與非特異性產(chǎn)物（如引物二聚體）的關鍵，務必進行并正確解讀。
本試劑盒為染料法 (SYBR Green I)，對引物特異性和反應條件要求較高。引物二聚體或非特異擴增會產(chǎn)生假陽性信號。務必優(yōu)化反應條件并仔細分析熔解曲線。
Ct值與樣本中蟲體數(shù)量/感染強度呈負相關，但直接轉換為蟲體數(shù)量需要建立標準曲線并與蟲荷計數(shù)建立相關性模型。
結果判讀需結合臨床癥狀、流行病學史及其他實驗室檢查結果。
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關鍵字： 匙形古柏線蟲;染料法熒光定量;RT-PCR試劑盒;
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