馬皰疹病毒4型染料法熒光定量PCR試劑盒
商品屬性
產(chǎn)品名稱 | 馬皰疹病毒4型染料法熒光定量PCR試劑盒 | 英文名稱 | Equine Herpesvirus 4 Dye-based qPCR Kit |
規(guī)格 | 50T | 貨號(hào) | PR4338 |
產(chǎn)品基本信息
| 項(xiàng)目 | 內(nèi)容 |
| 檢測(cè)方法 | 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（SYBR Green I染料法） |
| 靶基因區(qū)域 | EHV-4 gB基因保守區(qū) |
| 檢測(cè)樣本類型 | 馬鼻拭子、全血（EDTA抗凝）、流產(chǎn)組織、腦脊液 |
| 儲(chǔ)存條件 | -20℃避光保存（有效期12個(gè)月） |
| 適用儀器 | ABI 7500, Bio-Rad CFX96, Roche LightCycler 480等主流qPCR儀 |
檢測(cè)原理
采用SYBR Green I熒光染料技術(shù)，特異性擴(kuò)增EHV-4的gB基因片段。通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)病毒核酸進(jìn)行絕對(duì)定量分析（copies/μL），靈敏度可達(dá)10 copies/μL。
試劑盒組分（50測(cè)試）
| 組分名稱 | 體積/數(shù)量 | 主要成分 |
| 2× SYBR Green qPCR Master Mix | 1.25 mL | HotStart Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg2?、SYBR Green I染料、穩(wěn)定劑 |
| EHV-4特異性引物混合液 | 200 μL | 上游引物：5'-CGGACAAACCGTCCTACTC-3'
下游引物：5'-GTAGTCGTCGGTGTCGTTGT-3' |
| EHV-4陽(yáng)性對(duì)照（PC） | 100 μL | 含gB基因重組質(zhì)粒（10? copies/μL） |
| 無(wú)核酸酶水（NFW） | 1 mL | RNase/DNase-free水 |
| NTC陰性對(duì)照 | 100 μL | TE緩沖液 |
操作流程
1. 樣本前處理
鼻拭子/組織樣本：使用病毒DNA提取試劑盒（推薦柱提法）提取核酸
全血樣本：需先進(jìn)行紅細(xì)胞裂解，再提取白細(xì)胞DNA
2. PCR反應(yīng)體系配制（20 μL體系）
| 組分 | 體積（μL） |
| 2× Master Mix | 10 |
| 引物混合液 | 2 |
| 模板DNA | 5 |
| NFW | 3 |
對(duì)照設(shè)置：每批實(shí)驗(yàn)需包含陽(yáng)性對(duì)照（PC） 和無(wú)模板對(duì)照（NTC）
3. 擴(kuò)增程序設(shè)置
| 步驟 | 溫度 | 時(shí)間 | 循環(huán)數(shù) | 信號(hào)采集 |
| 預(yù)變性 | 95℃ | 5 min | 1 | 關(guān)閉 |
| 變性 | 95℃ | 15 sec | | 關(guān)閉 |
| 退火 | 60℃ | 30 sec | 40 | 開(kāi)啟 |
| 延伸 | 72℃ | 10 sec | | 關(guān)閉 |
| 熔解曲線 | 65℃→95℃ | 0.5℃/sec | 1 | 開(kāi)啟 |
結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)
陽(yáng)性：
Ct值 ≤ 35.0
熔解曲線單峰（Tm = 85.0±0.5℃）
可疑：
35.0 < Ct值 ≤ 38.0 → 建議重復(fù)檢測(cè)
陰性：
Ct值 > 38.0 或無(wú)擴(kuò)增曲線
NTC無(wú)擴(kuò)增，PC Ct值在預(yù)期范圍內(nèi)（20-25）
定量分析：使用標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋（101~10? copies/μL）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2 ≥ 0.99
性能指標(biāo)
| 參數(shù) | 性能 |
| 靈敏度 | 10 copies/μL |
| 特異性 | 不與EHV-1、EIV、EAV交叉反應(yīng) |
| 重復(fù)性 | CV < 5%（n=10） |
| 檢測(cè)限（LoD）| 50 copies/mL樣本 |
注意事項(xiàng)
生物安全：
疑似感染樣本需在BSL-2實(shí)驗(yàn)室處理
廢棄反應(yīng)管需用10%次氯酸鈉浸泡后高壓滅菌
防污染措施：
核酸提取區(qū)、PCR配制區(qū)、擴(kuò)增區(qū)嚴(yán)格分區(qū)
使用帶濾芯吸頭及UV滅菌工作臺(tái)
質(zhì)量控制：
若NTC出現(xiàn)擴(kuò)增，本次實(shí)驗(yàn)無(wú)效
陽(yáng)性對(duì)照Ct值偏移>2.0需排查原因
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關(guān)鍵字： 馬皰疹病毒4型;染料法熒光定量;PCR試劑盒;
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