乳雙歧桿菌HN019探針?lè)晒舛縋CR試劑盒

商品屬性

預(yù)期用途

本試劑盒采用TaqMan探針?lè)晒舛縋CR（qPCR）技術(shù)，用于特異性檢測(cè)樣品中乳雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）HN019菌株的DNA。適用于食品、保健品、藥品、發(fā)酵制品、糞便樣本、環(huán)境樣本等中HN019菌株的定性和定量分析（需配合標(biāo)準(zhǔn)品）。

檢測(cè)原理

本試劑盒基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，利用特異性引物擴(kuò)增乳雙歧桿菌HN019菌株的靶基因片段（通常為菌株特異性基因或SNP位點(diǎn)區(qū)域）。反應(yīng)體系中包含一條與擴(kuò)增片段內(nèi)部序列特異性結(jié)合的熒光標(biāo)記探針（通常為TaqMan探針）。探針5'端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)（如FAM），3'端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)（如BHQ1）。當(dāng)探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光被淬滅基團(tuán)吸收。在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，Taq DNA聚合酶的5'→3'外切酶活性會(huì)將探針?biāo)猓箞?bào)告熒光基團(tuán)與淬滅熒光基團(tuán)分離，從而釋放熒光信號(hào)。熒光信號(hào)的強(qiáng)度與每個(gè)循環(huán)中擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量成正比，通過(guò)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的增長(zhǎng)，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板DNA的定量檢測(cè)。

主要組分

qPCR預(yù)混液 (2X)： 包含優(yōu)化的緩沖液、dNTPs、熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶、Mg2?等?？赡馨琑OX等被動(dòng)參比染料（取決于儀器需求）。

乳雙歧桿菌HN019特異性引物探針混合液： 包含針對(duì)HN019菌株設(shè)計(jì)的特異性正向引物、反向引物和熒光標(biāo)記探針（如FAM/BHQ1標(biāo)記）。濃度已優(yōu)化。

無(wú)核酸酶水： 用于稀釋和配制反應(yīng)體系。

陽(yáng)性對(duì)照 (Positive Control)： 含有已知濃度的乳雙歧桿菌HN019基因組DNA片段或質(zhì)粒DNA。

陰性對(duì)照 (Negative Control)： 無(wú)核酸酶水或不含目標(biāo)DNA的緩沖液。

需要自備的材料與設(shè)備

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（支持FAM通道，如ABI 7500, QuantStudio系列， Bio-Rad CFX系列， Roche LightCycler系列等）。

微量移液器（0.5-10μL, 10-100μL, 20-200μL）及配套無(wú)菌、無(wú)核酸酶吸頭。

無(wú)菌、無(wú)核酸酶的PCR反應(yīng)管或96孔/384孔PCR板。

渦旋混合器。

微型離心機(jī)。

冰盒。

生物安全柜或超凈工作臺(tái)（推薦用于樣品處理）。

DNA提取試劑盒： 用于從樣品中提取基因組DNA（需自備，推薦使用針對(duì)細(xì)菌或糞便樣本的DNA提取試劑盒）。

用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品（可選，如需絕對(duì)定量，需自備或使用試劑盒可能提供的標(biāo)準(zhǔn)品）。

 樣品DNA制備

使用合適的商業(yè)DNA提取試劑盒，按照其說(shuō)明書(shū)操作，從待測(cè)樣品（如益生菌產(chǎn)品、糞便、發(fā)酵液等）中提取基因組DNA。

提取的DNA應(yīng)盡快進(jìn)行qPCR檢測(cè)，或分裝后于-20°C或-80°C保存。

建議使用分光光度計(jì)（如NanoDrop）或熒光染料法（如Qubit）測(cè)定DNA濃度和純度（OD260/OD280應(yīng)在1.8-2.0之間）。注意： 對(duì)于復(fù)雜樣本（如糞便），雜質(zhì)可能影響定量準(zhǔn)確性，PCR抑制物檢測(cè)是必要的（可選做）。

操作步驟

試劑準(zhǔn)備與解凍： 取出試劑盒各組分，在室溫下完全解凍（除酶外），短暫離心后置于冰上備用。qPCR預(yù)混液解凍后需充分混勻。

反應(yīng)體系配制（以20μL體系為例，在冰上操作）：

qPCR預(yù)混液 (2X)： 10 μL

乳雙歧桿菌HN019引物探針混合液： 2 μL

模板DNA： 2-5 μL (建議加入量對(duì)應(yīng)DNA濃度在1-100 ng/μL范圍內(nèi)，或根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化)

無(wú)核酸酶水： 補(bǔ)足至 20 μL

示例總量： 20 μL

注意： 模板加入體積和濃度需優(yōu)化，避免抑制劑干擾或濃度過(guò)高導(dǎo)致抑制。每個(gè)樣本建議設(shè)置復(fù)孔。

對(duì)照設(shè)置：

陽(yáng)性對(duì)照孔： 用陽(yáng)性對(duì)照DNA代替模板DNA。

陰性對(duì)照孔 (NTC)： 用等體積無(wú)核酸酶水代替模板DNA。

樣品陰性對(duì)照 (可選)： 使用確認(rèn)為不含HN019的同類樣品DNA。

混勻與離心： 輕輕渦旋或移液器吹打混勻各反應(yīng)管/孔，避免產(chǎn)生氣泡。短暫離心收集管壁液滴。

上機(jī)運(yùn)行： 將反應(yīng)管/板放入qPCR儀中，按照以下推薦的循環(huán)程序設(shè)置運(yùn)行：

預(yù)變性： 95°C, 3-5分鐘 (激活熱啟動(dòng)酶)

循環(huán)擴(kuò)增 (40-45個(gè)循環(huán))：

變性： 95°C, 10-15秒

退火/延伸： 60°C, 30-60秒 (此步采集FAM通道熒光信號(hào) - 關(guān)鍵步驟)

注：退火溫度和時(shí)間需根據(jù)實(shí)際引物探針設(shè)計(jì)優(yōu)化，通常說(shuō)明書(shū)會(huì)明確給出。

數(shù)據(jù)分析： 運(yùn)行結(jié)束后，儀器軟件會(huì)自動(dòng)生成擴(kuò)增曲線和Ct (Threshold Cycle) 值。

設(shè)定閾值 (Threshold)： 通常在指數(shù)擴(kuò)增期的上方，手動(dòng)或自動(dòng)設(shè)置，確保所有分析使用同一閾值。

設(shè)定基線 (Baseline)： 通常是前3-15個(gè)循環(huán)的背景熒光。

注意事項(xiàng)

污染控制： qPCR極其靈敏，必須嚴(yán)格分區(qū)操作（樣品準(zhǔn)備區(qū)、試劑配制區(qū)、擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)），使用帶濾芯吸頭，勤換手套，定期清潔臺(tái)面和儀器，避免氣溶膠污染。嚴(yán)禁將PCR產(chǎn)物帶入前區(qū)。

試劑保存： -20℃避光保存。避免反復(fù)凍融，建議分裝使用。使用前請(qǐng)充分混勻。解凍后在冰上操作。

模板要求： DNA樣品應(yīng)無(wú)降解，避免含有PCR抑制劑（如酚、氯仿、EDTA、肝素、腐殖酸、某些金屬離子、高濃度鹽等）。建議使用已知抑制物檢測(cè)試劑盒驗(yàn)證或進(jìn)行適當(dāng)稀釋。

反應(yīng)體系優(yōu)化： 首次使用或更換不同來(lái)源樣品時(shí)，建議對(duì)模板加入量進(jìn)行優(yōu)化（如測(cè)試不同稀釋倍數(shù)）。

儀器校準(zhǔn)： 定期對(duì)qPCR儀進(jìn)行光學(xué)校準(zhǔn)和背景校準(zhǔn)。

結(jié)果解釋： qPCR檢測(cè)的是特定DNA片段的存在，不能直接等同于活性菌的數(shù)量。樣品中可能存在死菌或游離DNA。定量結(jié)果需結(jié)合DNA提取效率、樣品類型等因素綜合判斷。

生物安全： 陽(yáng)性對(duì)照可能含有DNA片段，需按生物廢棄物處理。

公司正在出售的產(chǎn)品