商品屬性
產(chǎn)品名稱 | NADH氧化酶（NOX）測試盒 | 產(chǎn)品貨號 | BH-96117 |
規(guī)格 | 100管/96樣、50管/48樣 | 產(chǎn)品分類 | 輔酶Ⅰ系列 |
測試方法 | 微量法、可見分光光度法 | 用途 | 僅供科研實驗 |
測定意義與原理
測定意義
NADH氧化酶（NOX，EC1.6.3.1）是一類跨膜蛋白復(fù)合物，主要功能包括：活性氧（ROS）生成：催化NADH氧化生成O??，是細(xì)胞內(nèi)ROS的主要來源信號轉(zhuǎn)導(dǎo)：參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生理過程的信號調(diào)節(jié)免疫防御：吞噬細(xì)胞通過NOX生成ROS殺滅病原體病理關(guān)聯(lián)：NOX活性異常與心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、腫瘤、糖尿病等密切相關(guān)
測定原理
NOX催化NADH氧化生成NAD+，同時將電子傳遞給O?生成O??，通過偶聯(lián)顯色反應(yīng)檢測O??含量變化，計算酶活性： NADH+O2→NOXNAD++H2O2NADH+O2NOXNAD++H2O2 生成的O??與顯色劑反應(yīng)生成有色產(chǎn)物，在530nm處有特征吸收，吸光度增加速率與NOX活性成正比。
自備儀器與試劑
必備儀器
紫外分光光度計/酶標(biāo)儀（具備530nm檢測通道）
臺式高速離心機(jī)（最大轉(zhuǎn)速≥12000g）
恒溫水浴鍋（控溫精度±0.5℃）
可調(diào)式移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）
超聲破碎儀（用于細(xì)胞/細(xì)菌樣本處理）
必備耗材
1mL玻璃比色皿/96孔板
離心管（1.5mL、10mL）
一次性吸頭（無菌無酶）
研缽/組織勻漿器（冰浴專用）
自備試劑
蒸餾水/去離子水
生理鹽水（用于樣本稀釋）
液氮（用于樣本速凍保存）
樣本前處理方法
組織樣本（動植物）新鮮樣本取材后立即液氮速凍，-80℃保存；避免反復(fù)凍融稱取0.05-0.1g組織，按1:5-10（W/V）比例加入預(yù)冷的提取液冰浴勻漿（轉(zhuǎn)速1000-1500rpm，時間5-10min）轉(zhuǎn)移至離心管，12000g 4℃離心15min，取上清液置冰上待測若酶活性過高，可用提取液稀釋后測定（建議稀釋倍數(shù)1-10倍）
細(xì)胞/細(xì)菌樣本收集對數(shù)生長期細(xì)胞（密度1×10^6/mL）或細(xì)菌（OD600=0.6-0.8）8000g 4℃離心5min，棄上清，用生理鹽水洗滌2次按500萬細(xì)胞/細(xì)菌加入1mL提取液的比例重懸冰浴超聲破碎（功率30%，超聲5s，間隔10s，重復(fù)20次）12000g 4℃離心10min，取上清液置冰上待測
血清/血漿/尿液樣本血清樣本：血液凝固后3000g 4℃離心10min，取上清血漿樣本：加入抗凝劑后3000g 4℃離心10min，取上清尿液樣本：直接取上清，若渾濁需3000g離心5min后取上清以上樣本可直接檢測，無需提取處理
測定操作步驟
比色法操作流程
試劑準(zhǔn)備：
從4℃取出試劑盒，室溫平衡20min
試劑A：顯色劑，直接使用
試劑B：NADH溶液，使用前用蒸餾水稀釋5倍
試劑C：反應(yīng)緩沖液，直接使用
空白管設(shè)置：
取比色皿，依次加入：試劑C 900μL + 試劑B 50μL + 蒸餾水 50μL
37℃預(yù)溫育5min，記錄530nm處初始吸光度A0
樣本測定：
另取比色皿，依次加入：試劑C 900μL + 試劑B 50μL + 樣本 50μL
37℃預(yù)溫育5min，立即記錄530nm處吸光度A1
繼續(xù)反應(yīng)10min，記錄吸光度A2
微量法（酶標(biāo)儀）操作流程96孔板每孔加入：試劑C 90μL + 試劑B 5μL + 樣本 5μL37℃預(yù)溫育5min，酶標(biāo)儀設(shè)置動力學(xué)模式，530nm處連續(xù)讀取10個循環(huán)（每1min讀取1次）計算吸光度增加速率（ΔA/min）
酶活力計算方法
單位定義
U/mL：每mL樣本每分鐘生成1μmol O??的酶量
U/mgprot：每mg組織蛋白每分鐘生成1μmol O??的酶量
U/g鮮重：每g組織鮮重每分鐘生成1μmol O??的酶量
U/10?cell：每1萬個細(xì)胞每分鐘生成1μmol O??的酶量
計算公式
NOX活性=(ΔA樣本?ΔA空白)×V反總×V樣總ε×d×V樣測×T×CNOX活性=ε×d×V樣測×T×C(ΔA樣本?ΔA空白)×V反總×V樣總
ΔA：吸光度變化值（A2 - A1）
V反總：反應(yīng)體系總體積（1.0mL）
V樣總：樣本提取液總體積（mL）
ε：顯色產(chǎn)物摩爾消光系數(shù)（3.6×10? L/(mol·cm)）
d：比色皿光徑（1cm）
V樣測：測定時加入的樣本體積（0.05mL）
T：反應(yīng)時間（10min）
C：樣本濃度（蛋白濃度mg/mL、組織鮮重g/mL、細(xì)胞數(shù)10?/mL）
簡化公式
血清/血漿樣本：NOX（U/mL）= 2.78 × ΔA
組織樣本（蛋白濃度）：NOX（U/mgprot）= 2.78 × ΔA ÷ Cpr
組織樣本（鮮重）：NOX（U/g鮮重）= 2.78 × ΔA ÷ W
細(xì)胞/細(xì)菌樣本：NOX（U/10?cell）= 0.056 × ΔA
注意事項
樣本處理：
樣本需新鮮制備，避免反復(fù)凍融；若無法立即檢測，-80℃可保存2周
組織勻漿與超聲破碎需在冰浴中進(jìn)行，避免酶失活
離心時需控制溫度與轉(zhuǎn)速，確保充分分離細(xì)胞器
試劑使用：
試劑B（NADH）對光敏感，配制后需避光保存，24小時內(nèi)用完
顯色劑需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免氧化失效
不同批號試劑禁止混用，避免影響檢測結(jié)果
測定過程：
若ΔA值大于0.6，建議將樣本稀釋后重新測定
反應(yīng)溫度需嚴(yán)格控制在37℃（哺乳動物樣本）或25℃（植物樣本）
測定前需用蒸餾水校正分光光度計零點
質(zhì)量控制：
每次實驗需設(shè)置空白對照、陰性對照與陽性對照
若結(jié)果偏差較大，需檢查樣本處理過程與試劑配制是否正確
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關(guān)鍵字： NADH氧化酶;NOX;測試盒;
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