NADH氧化酶（NADH oxidase，NOX）試劑盒說明書

                                                 微量法 100管/96樣

正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定                                             

測定意義：

NOX（EC 1.6.99.3）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，可在氧氣存在下，直接將NADH氧化為NAD。該酶不僅參與NAD的再生，而且與免疫反應(yīng)密切相關(guān)。

測定原理：

NOX能夠?qū)ADH氧化為NAD，NADH的氧化與2,6二氯酚靛藍（DCPIP）的還原相偶聯(lián)，藍色的DCPIP被還原為無色的DCPIP，在600nm下測定藍色DCPIP的還原速率計算出NADH氧化酶活性的大小。

組成：

試劑五：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入5ml蒸餾水，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

自備儀器和用品：

酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、96孔板、研缽、冰、蒸餾水

樣本的前處理：

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1. 準確稱取0.1g組織或收集500萬細胞（OD=0.5的大腸桿菌溶液稀釋100倍取1ml所獲得的菌體數(shù)量約為500萬個），加入1ml試劑一和10μl 試劑三，進行勻漿。

2. 勻漿結(jié)束后，600xg、4℃離心5min。

3. 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11100xg、4℃離心10min。

4. 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線粒體泄漏的NOX（此步可選做）。

5. 步驟④中的沉淀即為線粒體，加入200μl試劑二和2μl 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10秒，重復(fù)30次），用于NOX活性測定。

血清（漿）樣品：800xg、4℃離心10min，吸取上清進行檢測。

測定步驟：

1. 酶標儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至600nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 樣本測定

（1）試劑四、試劑五于37℃（哺乳動物樣品）或25℃（其它物種樣品）預(yù)熱5min。

（2）在2ml EP管中加入中加入10μl樣本、200μl試劑四和40μl試劑五，混勻，吸取200μl至96孔板中使用動力學(xué)程序記錄600nm處的初始吸光值A(chǔ)1和反應(yīng)1min后的吸光值A(chǔ)2，計算ΔA=A1-A2。

NOX活力單位的計算

1、血清（漿）NOX活力的計算:

單位的定義：每ml血清（漿）在每ml反應(yīng)體系中每分鐘A600變化0.005定義為一個酶活力單位。

NOX（U/ml）＝ΔA×V反總÷V樣÷0.01÷T=5000×ΔA 

2、組織、細菌或細胞中NOX活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白在每ml反應(yīng)體系中每分鐘A600變化0.005定義為一個酶活力單位。

NOX（U/mg prot）=ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.005÷T=5000×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織在每ml反應(yīng)體系中每分鐘A600變化0.005定義為一個酶活力單位。

NOX（U/g 鮮重）=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.005÷T=1010×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞在每ml反應(yīng)體系中每分鐘A600變化0.005定義為一個酶活力單位。

NOX（U/104 cell）=ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.005÷T=2.02×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.25ml； V樣：加入樣本體積，0.01ml；V樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應(yīng)時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量；500：細胞或細菌總數(shù)，500萬。