商品屬性
產(chǎn)品名稱 | 6磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH）/葡萄糖6磷酸脫氫酶測試盒 | 產(chǎn)品貨號 | BH-961118 |
規(guī)格 | 100管/96樣、50管/48樣 | 產(chǎn)品分類 | 輔酶Ⅱ系列 |
測試方法 | 微量法、紫外分光光度法 | 用途 | 僅供科研實(shí)驗(yàn) |
測定意義與原理
測定意義
6磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH，EC1.1.1.49）是磷酸戊糖途徑（PPP）的關(guān)鍵限速酶，主要功能包括：能量代謝：催化葡萄糖-6-磷酸氧化生成6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯，同時(shí)生成NADPH抗氧化防御：NADPH是谷胱甘肽還原酶、硫氧還蛋白還原酶的輔酶，維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)臨床診斷：G6PDH缺乏是最常見的遺傳性酶病，引起新生兒黃疸、溶血性貧血等疾病關(guān)聯(lián)：G6PDH活性異常與腫瘤、糖尿病、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病等相關(guān)工業(yè)應(yīng)用：用于啤酒釀造、生物燃料生產(chǎn)等領(lǐng)域
測定原理
G6PDH催化葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）脫氫生成6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯，同時(shí)將NADP+還原為NADPH： G-6-P+NADP+→G6PDH6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯+NADPH+H+G-6-P+NADP+G6PDH6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯+NADPH+H+ NADPH在340nm處有特征吸收峰，通過監(jiān)測吸光度增加速率計(jì)算G6PDH活性。
自備儀器與試劑
必備儀器
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀（340nm檢測通道）
臺(tái)式高速離心機(jī)（≥12000rpm）
恒溫水浴鍋（控溫精度±0.5℃）
可調(diào)式移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）
超聲破碎儀（用于細(xì)胞/細(xì)菌樣本）
必備耗材
1mL石英比色皿/微量石英比色皿/96孔板
離心管（1.5mL、10mL）
一次性無菌吸頭
研缽/組織勻漿器（冰浴專用）
自備試劑
蒸餾水/去離子水
生理鹽水（用于樣本稀釋）
液氮（用于樣本速凍保存）
樣本前處理方法
植物/動(dòng)物組織樣本新鮮樣本取材后立即液氮速凍，-80℃保存；避免反復(fù)凍融稱取0.1g組織，按1:5-10（W/V）比例加入預(yù)冷提取液冰浴勻漿（轉(zhuǎn)速1000-1500rpm，時(shí)間5-10min）12000rpm 4℃離心20min，取上清液置冰上待測；若活性過高可稀釋1-5倍
細(xì)胞/細(xì)菌樣本收集對數(shù)生長期細(xì)胞（密度1×10^6/mL）或細(xì)菌（OD600=0.6-0.8）8000g 4℃離心5min棄上清，用生理鹽水洗滌2次按500萬細(xì)胞/細(xì)菌加入1mL提取液的比例重懸冰浴超聲破碎（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）10000rpm 4℃離心10min，取上清液置冰上待測
血清/血漿/紅細(xì)胞樣本血清樣本：血液凝固后3000g 4℃離心10min，取上清血漿樣本：加入抗凝劑后3000g 4℃離心10min，取上清紅細(xì)胞樣本：取抗凝血3000g離心5min，棄上清，用生理鹽水洗滌3次，按1:10比例加入蒸餾水溶血以上樣本可直接檢測，無需提取處理；活性過高時(shí)可用生理鹽水稀釋
測定操作步驟
紫外分光光度法操作
試劑準(zhǔn)備：
試劑一：反應(yīng)緩沖液，直接使用
試劑二：NADP+溶液，使用前用蒸餾水稀釋10倍
試劑三：葡萄糖-6-磷酸溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用，-20℃可保存1周
試劑四：提取液，直接使用
預(yù)溫育：
取比色皿，依次加入：試劑一920μL + 稀釋后NADP+溶液20μL + 樣本40μL
37℃預(yù)溫育5min，記錄340nm處初始吸光度A1
反應(yīng)啟動(dòng)：
加入底物溶液20μL，立即混勻，開始計(jì)時(shí)
分別記錄1min（A2）、2min（A3）時(shí)的吸光度值
計(jì)算ΔA：ΔA = (A2 - A1) + (A3 - A2)
微量法（酶標(biāo)儀）操作流程96孔板每孔加入：試劑一92μL + 稀釋后NADP+溶液2μL + 樣本4μL37℃預(yù)溫育5min，加入底物溶液2μL立即混勻設(shè)置動(dòng)力學(xué)模式，340nm處連續(xù)讀取10個(gè)循環(huán)（每1min讀取1次）計(jì)算吸光度增加速率（ΔA/min）
酶活力計(jì)算方法
單位定義
U/g鮮重：每g組織鮮重每分鐘生成1μmol NADPH的酶量
U/mL：每mL液體樣本每分鐘生成1μmol NADPH的酶量
U/mgprot：每mg蛋白每分鐘生成1μmol NADPH的酶量
U/10?cell：每100萬個(gè)細(xì)胞每分鐘生成1μmol NADPH的酶量
計(jì)算公式
G6PDH活性(U/mgprot)=ΔA×V反總×106ε×d×Cpr×V樣×TG6PDH活性(U/mgprot)=ε×d×Cpr×V樣×TΔA×V反總×106
ΔA：吸光度變化值（A3 - A1）
V反總：反應(yīng)體系總體積（1.0mL）
ε：NADPH摩爾消光系數(shù)（6.22×103 L/(mol·cm)）
d：比色皿光徑（1cm）
Cpr：樣本蛋白濃度（mg/mL）
V樣：測定時(shí)加入的樣本體積（0.04mL）
T：反應(yīng)時(shí)間（2min）
簡化公式
組織樣本（蛋白濃度）：G6PDH（U/mgprot）= 20.1 × ΔA ÷ Cpr
組織樣本（鮮重）：G6PDH（U/g鮮重）= 20.1 × ΔA ÷ W
液體樣本：G6PDH（U/mL）= 20.1 × ΔA
細(xì)胞/細(xì)菌樣本：G6PDH（U/10?cell）= 0.000201 × ΔA ÷ N
注意事項(xiàng)
樣本處理：
G6PDH對溫度敏感，所有操作需在冰浴中進(jìn)行
樣本需新鮮制備，-80℃保存不超過1個(gè)月
避免樣本接觸金屬離子，可用EDTA螯合
紅細(xì)胞樣本溶血后需立即檢測，避免酶失活
試劑使用：
NADP+溶液對光敏感，配制后需避光保存
葡萄糖-6-磷酸溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免降解
不同批號試劑不能混用，需重新測定標(biāo)準(zhǔn)曲線
測定過程：
反應(yīng)溫度需嚴(yán)格控制在37℃（哺乳動(dòng)物樣本）或25℃（植物樣本）
若ΔA值超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，需調(diào)整稀釋倍數(shù)重新測定
每個(gè)樣本需設(shè)置3個(gè)平行孔，取平均值計(jì)算
質(zhì)量控制：
每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對照和陽性對照
定期校準(zhǔn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀，確保波長準(zhǔn)確性
若結(jié)果偏差較大，需檢查試劑是否變質(zhì)、樣本處理是否正確
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關(guān)鍵字： 6磷酸葡萄糖脫氫酶;G6PDH;測試盒;
派瑞曼pyram?是上海博湖生物科技有限公司（Shanghai Bohu Biological Technology Co., Ltd.，China）的產(chǎn)品品牌。
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