葡萄糖6磷酸(6PG)測試盒

測定意義與原理

測定意義

6PG（葡萄糖-6-磷酸）是糖酵解和磷酸戊糖途徑的中間產(chǎn)物，廣泛存在于動(dòng)植物體和微生物中，其含量測定具有重要意義：臨床診斷：診斷和監(jiān)測遺傳性葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥、溶血性貧血、神經(jīng)肌肉疾病等疾病監(jiān)測：評(píng)估細(xì)胞能量代謝狀態(tài)、組織損傷程度和治療效果生物學(xué)研究：了解細(xì)胞內(nèi)糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑和細(xì)胞增殖機(jī)制藥物研發(fā)：篩選抗癌藥物、神經(jīng)保護(hù)藥物等植物學(xué)研究：研究植物光合作用、碳代謝途徑、抗逆性機(jī)制

測定原理

6-磷酸葡萄糖脫氫酶可催化6PG和NADP+生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH，NADPH在1-mPMS的作用下使WST-8顯橙黃色，在450nm下測定吸光值。反應(yīng)式如下： 6PG+NADP+→6-磷酸葡萄糖脫氫酶6-磷酸葡萄糖酸+NADPH6PG+NADP+6-磷酸葡萄糖脫氫酶6-磷酸葡萄糖酸+NADPH NADPH+WST-8+1-mPMS→橙黃色化合物NADPH+WST-8+1-mPMS→橙黃色化合物

試劑盒組成

分光光度法/微量法試劑盒

組分 規(guī)格 作用說明

提取液 液體60mL×1瓶 用于提取樣本中的6PG

試劑一 液體45mL×1瓶 含反應(yīng)緩沖液，用于提供適宜的反應(yīng)pH環(huán)境

試劑二 粉劑×1瓶 含NADP+溶液，反應(yīng)底物

試劑三 粉劑×1瓶 含WST-8溶液，顯色劑

標(biāo)準(zhǔn)品 1mL×1支 含6PG標(biāo)準(zhǔn)液，用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

ELISA法試劑盒

組分 規(guī)格 作用說明

包被板 96孔×1塊 預(yù)包被抗6PG單克隆抗體

酶標(biāo)抗體 液體6mL×1瓶 含HRP標(biāo)記抗6PG抗體

標(biāo)準(zhǔn)品 液體1mL×6管 含0.1-10ng/mL 6PG標(biāo)準(zhǔn)品

樣本稀釋液 10mL×1瓶 用于稀釋樣本和標(biāo)準(zhǔn)品

顯色劑A液 6mL×1瓶 含過氧化氫溶液

顯色劑B液 6mL×1瓶 含TMB溶液

終止液 6mL×1瓶 含硫酸溶液

20倍濃縮洗滌液 20mL×1瓶 用于洗滌酶標(biāo)板

自備儀器與試劑

必備儀器

分光光度法/微量法：紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、恒溫水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL石英比色皿/96孔板、研缽、電子天平

ELISA法：酶標(biāo)儀（450nm檢測通道）、96孔板、37℃恒溫箱、洗板機(jī)、可調(diào)式移液器、臺(tái)式離心機(jī)

必備耗材

離心管（1.5mL/10mL）、一次性吸頭、研缽/組織勻漿器、超聲破碎儀

自備試劑：蒸餾水/去離子水、生理鹽水

樣本前處理方法

動(dòng)植物組織樣本取樣：按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿離心：8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測

細(xì)胞/微生物樣本收集：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清破碎：按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10?個(gè)）:提取液體積(mL)為500~1000:1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20%或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）離心：8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測

血清/血漿樣本

血清(漿)樣品：直接檢測

測定操作步驟

分光光度法/微量法操作儀器預(yù)熱：分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到450nm，蒸餾水調(diào)零試劑配制：

試劑二：臨用前加入1.5mL蒸餾水充分溶解備用

試劑三：臨用前加入1.5mL蒸餾水充分溶解備用樣本測定：

試劑名稱(μL) 空白管 測定管

蒸餾水/樣本 100 100

試劑一 700 700

試劑二 100 100

試劑三 100 100

混勻后立即記錄450nm處反應(yīng)5min時(shí)的吸光值A(chǔ)1和10min時(shí)的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A2-A1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：將6PG標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成0、10、20、30、40、50U/L系列濃度，同樣處理，測定10min內(nèi)吸光度變化，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

ELISA法操作試劑準(zhǔn)備：將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，室溫平衡15-30分鐘；將20×洗滌緩沖液用蒸餾水20倍稀釋后備用加樣：

從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃

設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加溫育：除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入HRP標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min洗滌：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）顯色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min終止：每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值結(jié)果計(jì)算：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按曲線方程計(jì)算樣本濃度

結(jié)果計(jì)算方法

單位定義

nmol/g 鮮重：每克組織中6PG的含量

nmol/mg prot：每毫克組織蛋白中6PG的含量

nmol/L：每升樣本中6PG的含量

分光光度法/微量法計(jì)算公式

6PG含量(nmol/g 鮮重)=C×V總W6PG含量(nmol/g 鮮重)=WC×V總 6PG含量(nmol/mg prot)=C×V總Cpr6PG含量(nmol/mg prot)=CprC×V總 6PG含量(nmol/L)=C×稀釋倍數(shù)6PG含量(nmol/L)=C×稀釋倍數(shù)

C：根據(jù)樣本吸光度值從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的6PG濃度（nmol/L）

V總：樣本提取液總體積（L）

W：樣本質(zhì)量（g）

Cpr：樣本蛋白濃度（mg/mL）

ELISA法計(jì)算公式

6PG含量(ng/mL)=樣本OD值?空白OD值標(biāo)準(zhǔn)品OD值?空白OD值×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×稀釋倍數(shù)6PG含量(ng/mL)=標(biāo)準(zhǔn)品OD值?空白OD值樣本OD值?空白OD值×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×稀釋倍數(shù)

性能指標(biāo)

指標(biāo) 分光光度法/微量法 ELISA法

線性范圍 0~50U/L 0.1-10ng/mL

最低檢測限 ≤0.1U/L ≤0.05ng/mL

回收率 90%~110% 90%~110%

批內(nèi)精密度 CV≤2.2% CV≤3.8%

批間精密度 CV≤5.0% CV≤8.5%

穩(wěn)定性 2-8℃保存6-12個(gè)月 2-8℃保存6-12個(gè)月

注意事項(xiàng)

樣本處理：

樣本需新鮮制備，避免6PG失活；-20℃可保存3個(gè)月

組織樣本需冰浴勻漿，避免酶失活

液體樣本需避免溶血和細(xì)菌污染

試劑使用：

試劑需臨用前配制，避免氧化失效

不同批號(hào)試劑不能混用，需重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)品需4℃保存，避免反復(fù)凍融

測定過程：

反應(yīng)溫度需嚴(yán)格控制在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）

加入樣品啟動(dòng)反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻比色測定

若吸光度值超出線性范圍，需稀釋樣本后重新測定

質(zhì)量控制：

每次實(shí)驗(yàn)需設(shè)置空白對(duì)照和質(zhì)控樣本

定期校準(zhǔn)儀器，確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確性

若結(jié)果偏差較大，需檢查試劑是否變質(zhì)或樣本處理是否正確

公司正在出售的產(chǎn)品