琥珀酸脫氫酶（SDH)測試盒

測定意義與原理

測定意義

琥珀酸脫氫酶（SDH, EC 1.3.5.1）是線粒體的一種標志酶，位于線粒體內(nèi)膜上的一種膜結(jié)合酶，是連接呼吸電子傳遞和氧化磷酸化的樞紐之一。其測定具有重要的臨床和科研價值：臨床診斷：診斷和監(jiān)測線粒體疾病、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、糖尿病等疾病監(jiān)測：評估細胞能量代謝狀態(tài)、組織損傷程度和治療效果生物學研究：了解線粒體功能、細胞凋亡和細胞增殖機制環(huán)境監(jiān)測：評估環(huán)境污染對生物線粒體的影響農(nóng)業(yè)研究：篩選抗逆作物品種，提高作物產(chǎn)量食品檢測：檢測食品新鮮度和微生物污染程度

測定原理

比色法和紫外分光光度法基于SDH催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸，脫下的氫通過吩嗪二甲酯硫酸（PMS）傳遞還原2,6-二氯酚靛酚（DCPIP），DCPIP在600nm處具有特征吸收峰，通過600nm吸光度的變化，測定DCPIP的還原速度，代表SDH酶活性。反應式如下： 琥珀酸+FAD→SDH延胡索酸+FADH2琥珀酸+FADSDH延胡索酸+FADH2 FADH2+PMS→FAD+PMSH2FADH2+PMS→FAD+PMSH2 PMSH2+DCPIP→PMS+DCPIPH2PMSH2+DCPIP→PMS+DCPIPH2

ELISA法基于抗原抗體特異性結(jié)合原理，通過檢測樣本中SDH的含量，間接反映SDH的活性。

試劑盒組成

比色法/紫外分光光度法試劑盒

組分 規(guī)格 作用說明

試劑一 25mL×1瓶 含琥珀酸鈉溶液，反應底物

試劑二 25mL×1瓶 含PMS溶液，電子傳遞體

試劑三 10mL×1瓶 含DCPIP溶液，電子受體

試劑四 25mL×1瓶 含提取液，用于提取樣本中的SDH

試劑五 粉劑×1瓶 含穩(wěn)定劑，用于穩(wěn)定SDH活性

ELISA法試劑盒

組分 規(guī)格 作用說明

包被板 96孔×1塊 預包被抗SDH單克隆抗體

酶標抗體 液體6mL×1瓶 含HRP標記抗SDH抗體

標準品 液體1mL×6管 含0、2、4、8、16、32、64U/L SDH標準品

樣本稀釋液 10mL×1瓶 用于稀釋樣本和標準品

顯色劑A液 6mL×1瓶 含過氧化氫溶液

顯色劑B液 6mL×1瓶 含TMB溶液

終止液 6mL×1瓶 含硫酸溶液

20倍濃縮洗滌液 20mL×1瓶 用于洗滌酶標板

自備儀器與試劑

必備儀器

比色法/紫外分光光度法：可見分光光度計/酶標儀（600nm檢測通道）、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水

ELISA法：酶標儀（450nm檢測通道）、96孔板、37℃恒溫箱、洗板機

必備耗材

離心管（1.5mL/10mL）、一次性吸頭、研缽/組織勻漿器

自備試劑：蒸餾水/去離子水、生理鹽水、三氯乙酸

樣本前處理方法

動植物組織樣本取樣：稱取約0.1-0.2g組織，用生理鹽水洗凈表面雜質(zhì)，用濾紙吸干勻漿：按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例進行冰浴勻漿離心：10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測稀釋：若SDH活性過高，用提取液稀釋1-10倍后測定

細胞樣本收集：收集1×10?細胞，加入1mL試劑一破碎：冰浴超聲波破碎（功率20%，超聲3s，間隔10s，重復30次）離心：10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測

血清/血漿樣本

血清/血漿：直接測定；若濃度過高，用提取液稀釋10-20倍

尿液：離心去除沉淀，取上清液測定；或用提取液稀釋10-20倍

測定操作步驟

比色法/紫外分光光度法操作儀器預熱：分光光度計預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到600nm，用蒸餾水調(diào)零試劑配制：

試劑四：臨用前加入18mL蒸餾水充分溶解，置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融

試劑五：臨用前加入1mL蒸餾水，充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融樣品測定：

取10μL樣本、10μL試劑五和180μL試劑四，混勻，立即記錄600nm處0min和1min的光吸收值A(chǔ)1和A2，計算ΔA=A1-A2

同時設(shè)置空白對照，用蒸餾水替代樣本，同樣操作記錄吸光值變化標準曲線繪制：將SDH標準品稀釋成0、10、20、30、40、50U/L系列濃度，同樣處理，測定1min內(nèi)吸光值變化，繪制標準曲線

ELISA法操作試劑準備：將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，室溫平衡15-30分鐘；將20×洗滌緩沖液用蒸餾水20倍稀釋后備用加樣：

從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃

設(shè)置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加溫育：除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入HRP標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min洗滌：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）顯色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min終止：每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值結(jié)果計算：繪制標準曲線，按曲線方程計算樣本濃度

結(jié)果計算方法

單位定義

U/mg prot：每毫克組織蛋白每分鐘催化反應的酶量

U/g 鮮重：每克鮮重樣本每分鐘催化反應的酶量

U/L：每升樣本每分鐘催化反應的酶量

比色法/紫外分光光度法計算公式

SDH活性(U/mg prot)=(ΔA樣本?ΔA空白)×V總Cpr×V樣×ε×d×T×106SDH活性(U/mg prot)=Cpr×V樣×ε×d×T(ΔA樣本?ΔA空白)×V總×106

ΔA樣本：樣本管吸光度變化值

ΔA空白：空白管吸光度變化值

V總：反應體系總體積（L）

Cpr：樣本蛋白濃度（mg/mL）

V樣：樣本體積（L）

ε：DCPIP摩爾消光系數(shù)（L/mol/cm）

d：比色皿光徑（cm）

T：反應時間（min）

ELISA法計算公式

SDH含量(U/L)=樣本OD值?空白OD值標準品OD值?空白OD值×標準品濃度×稀釋倍數(shù)SDH含量(U/L)=標準品OD值?空白OD值樣本OD值?空白OD值×標準品濃度×稀釋倍數(shù)

性能指標

指標 比色法/紫外分光光度法 ELISA法

線性范圍 0~50U/L 0~64U/L

最低檢測限 ≤0.1U/L ≤0.1U/L

回收率 90%~110% 90%~110%

批內(nèi)精密度 CV≤5.0% CV≤10%

批間精密度 CV≤8.0% CV≤15%

穩(wěn)定性 2-8℃保存6-12個月 2-8℃保存6個月

注意事項

樣本處理：

樣本需新鮮制備，避免SDH失活；-20℃可保存3個月

組織樣本需冰浴勻漿，避免酶失活

液體樣本需避免溶血和細菌污染

試劑使用：

試劑四和試劑五需臨用前配制，避免失效

ELISA法試劑需避免反復凍融，用后立即放回2-8℃保存

不同批號試劑不能混用，需重新繪制標準曲線

測定過程：

比色法/紫外分光光度法反應溫度需嚴格控制在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種），反應時間1分鐘

ELISA法需嚴格控制溫育時間和溫度，避免影響顯色反應

若吸光度值超出線性范圍，需稀釋樣本后重新測定

質(zhì)量控制：

每次實驗需設(shè)置空白對照和質(zhì)控樣本

定期校準儀器，確保檢測結(jié)果準確性

若結(jié)果偏差較大，需檢查試劑是否變質(zhì)或樣本處理是否正確

其他注意事項：

操作時需戴手套和口罩，避免接觸皮膚和黏膜

所有試劑和樣本需妥善處理，避免污染環(huán)境

試劑盒需在有效期內(nèi)使用，過期試劑請勿使用

公司正在出售的產(chǎn)品