乳酸脫氫酶（LDH）測試盒
測定意義與原理
測定意義
LDH（EC1.1.1.27）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是糖酵解和糖異生途徑中的關(guān)鍵酶，其活性檢測具有重要意義：臨床診斷：診斷和監(jiān)測心肌梗死、肝臟疾病、溶血性疾病、腎臟疾病等疾病監(jiān)測：評估組織損傷程度、細(xì)胞凋亡和治療效果生物學(xué)研究：了解糖酵解途徑、細(xì)胞能量代謝和細(xì)胞增殖機(jī)制藥物研發(fā)：篩選抗凋亡藥物、抗腫瘤藥物等
測定原理
LDH催化乳酸氧化為丙酮酸，同時NAD+被還原為NADH，通過測定340nm處吸光度的增加速率，計算LDH活性。反應(yīng)式如下： 乳酸+NAD+→LDH丙酮酸+NADH+H+乳酸+NAD+LDH丙酮酸+NADH+H+
試劑盒組成
組分 規(guī)格 作用說明
提取液 液體60mL×1瓶 含提取液，用于提取樣本中的LDH
試劑一 液體45mL×1瓶 含反應(yīng)緩沖液，用于提供適宜的反應(yīng)pH環(huán)境
試劑二 粉劑×1瓶 含NAD+溶液，反應(yīng)底物
試劑三 粉劑×1瓶 含NAD+溶液，反應(yīng)輔助因子
標(biāo)準(zhǔn)品 1mL×1支 含LDH標(biāo)準(zhǔn)液，用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線
自備儀器與試劑
必備儀器
分光光度法/微量法/比色法：紫外分光光度計/酶標(biāo)儀/可見分光光度計、1mL石英比色皿/96孔板/1mL玻璃比色皿、臺式離心機(jī)、恒溫水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽、電子天平
熒光法：熒光分光光度計、微量石英比色皿、臺式離心機(jī)、恒溫水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽、電子天平
必備耗材
離心管（1.5mL/10mL）、一次性吸頭、研缽/組織勻漿器、超聲破碎儀
自備試劑：蒸餾水/去離子水、生理鹽水
樣本前處理方法
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞樣本收集：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清破碎：按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10?個）:提取液體積(mL)為500~1000:1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20%或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）離心：8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測
組織樣本取樣：按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿離心：8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測
血清/血漿樣本
血清(漿)樣品：直接檢測；若濃度過高，用生理鹽水稀釋5-10倍
測定操作步驟
儀器預(yù)熱：分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到340nm，蒸餾水調(diào)零試劑配制：
工作液：臨用前將試劑二全部倒入試劑一瓶中，37℃（哺乳動物）或25℃（其他物種）預(yù)熱10分鐘
試劑三稀釋：500μL試劑三加500μL蒸餾水，混勻后-20℃保存?zhèn)溆脴颖緶y定：
試劑名稱(μL) 空白管 測定管
蒸餾水/樣本 100 100
工作液 800 800
試劑三 100 100
混勻后立即記錄340nm處反應(yīng)5min時的吸光值A(chǔ)1和10min時的吸光值A(chǔ)2，計算ΔA=A2-A1
結(jié)果計算方法
單位定義
U/mg prot：每毫克組織蛋白每分鐘生成1nmol NADH的酶量
U/g 鮮重：每克鮮重樣本每分鐘生成1nmol NADH的酶量
U/L：每升樣本每分鐘生成1nmol NADH的酶量
計算公式
LDH活性(U/mg prot)=ΔA×V總ε×d×Cpr×T×V樣×109LDH活性(U/mg prot)=ε×d×Cpr×T×V樣ΔA×V總×109
ΔA：樣本管吸光度變化值
V總：反應(yīng)體系總體積（L）
ε：NADH摩爾消光系數(shù)（6.22×103 L/mol/cm）
d：比色皿光徑（cm）
Cpr：樣本蛋白濃度（mg/mL）
T：反應(yīng)時間（min）
V樣：樣本體積（L）
性能指標(biāo)
指標(biāo) 分光光度法/微量法/比色法/熒光法
線性范圍 0~50U/L
最低檢測限 ≤0.1U/L
回收率 90%~110%
批內(nèi)精密度 CV≤1.7%
批間精密度 CV≤5.0%
穩(wěn)定性 2-8℃保存6-12個月
注意事項
樣本處理：
樣本需新鮮制備，避免LDH失活；-20℃可保存3個月
組織樣本需冰浴勻漿，避免酶失活
液體樣本需避免溶血和細(xì)菌污染
試劑使用：
試劑需臨用前配制，避免氧化失效
不同批號試劑不能混用，需重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
標(biāo)準(zhǔn)品需4℃保存，避免反復(fù)凍融
測定過程：
反應(yīng)溫度需嚴(yán)格控制在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）
加入樣品啟動反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻比色測定
若吸光度值超出線性范圍，需稀釋樣本后重新測定
質(zhì)量控制：
每次實驗需設(shè)置空白對照和質(zhì)控樣本
定期校準(zhǔn)儀器，確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確性
若結(jié)果偏差較大，需檢查試劑是否變質(zhì)或樣本處理是否正確
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關(guān)鍵字： 乳酸脫氫酶;LDH;測試盒;
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