商品屬性
產(chǎn)品名稱(chēng) | L半乳糖酸1,4內(nèi)酯脫氫酶(Gal LDH)測(cè)試盒 | 產(chǎn)品貨號(hào) | BH-961140 |
規(guī)格 | 100管/96樣、50管/48樣 | 產(chǎn)品分類(lèi) | 維生素C代謝系列 |
測(cè)試方法 | 微量法、可見(jiàn)分光光度法 | 用途 | 僅供科研實(shí)驗(yàn) |
測(cè)定意義與原理
測(cè)定意義
Gal LDH是定位于線粒體內(nèi)膜的關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)催化植物體內(nèi)抗壞血酸（AsA）生物合成的最后一步，對(duì)植物體內(nèi)AsA含量的積累起著至關(guān)重要的作用。AsA是植物體內(nèi)重要的抗氧化劑，參與多種生理過(guò)程，包括：抗氧化防御：清除活性氧，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷光合作用：參與光合電子傳遞，調(diào)節(jié)光合效率細(xì)胞伸長(zhǎng)：調(diào)節(jié)細(xì)胞壁代謝，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)：作為信號(hào)分子，參與激素調(diào)節(jié)和脅迫響應(yīng)
測(cè)定原理
Gal LDH催化L-半乳糖內(nèi)酯氧化，同時(shí)還原細(xì)胞色素C（Cyt c），還原型Cyt c在550nm有特征吸收峰，通過(guò)測(cè)定還原型Cyt c增加速率，計(jì)算Gal LDH活性。反應(yīng)式如下： L-半乳糖內(nèi)酯+Cyt c(氧化型)→Gal LDHAsA+Cyt c(還原型)L-半乳糖內(nèi)酯+Cyt c(氧化型)Gal LDHAsA+Cyt c(還原型)
試劑盒組成
組分 規(guī)格 作用說(shuō)明
試劑一 50mL×1瓶/100mL×1瓶 含0.1mol/L Tris-HCl緩沖液，pH8.0，用于反應(yīng)體系構(gòu)建
試劑二 10mL×1瓶/20mL×1瓶 含0.5mmol/L細(xì)胞色素C，電子受體
試劑三 10mL×1瓶/20mL×1瓶 含10mmol/L L-半乳糖內(nèi)酯，反應(yīng)底物
試劑四 5mL×1瓶/10mL×1瓶 含0.1mol/L EDTA，金屬離子螯合劑
標(biāo)準(zhǔn)品 1×100U 用于校準(zhǔn)儀器，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線
提取液 100mL×1瓶 含0.1mol/L Tris-HCl緩沖液，pH7.4，用于樣本提取
自備儀器與試劑
必備儀器
可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀（550nm檢測(cè)通道）
低溫離心機(jī)（≥8000g）
恒溫水浴鍋（控溫精度±0.5℃）
可調(diào)式移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）
研缽/組織勻漿器（冰浴專(zhuān)用）
必備耗材
1mL玻璃比色皿/96孔板
離心管（1.5mL、10mL）
一次性無(wú)菌吸頭
手術(shù)剪/鑷子（用于組織樣本處理）
自備試劑
蒸餾水/去離子水
生理鹽水（0.85% NaCl）
抗凝劑（肝素/EDTA，僅用于血漿樣本）
樣本前處理方法
動(dòng)植物組織樣本取新鮮組織，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL預(yù)冷提取液，冰浴勻漿8000g 4℃離心10min，取上清液置冰上待測(cè)若酶活性過(guò)高，可用提取液稀釋1-5倍后測(cè)定
細(xì)菌/細(xì)胞樣本收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌/細(xì)胞，8000g 4℃離心5min棄上清按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(10?個(gè)):提取液體積(mL)=500~1000:1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率20%或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）8000g 4℃離心10min，取上清液置冰上待測(cè)
血清/血漿樣本血清樣本：血液凝固后3000g 4℃離心10min，取血清上清血漿樣本：加入抗凝劑（肝素/EDTA）后3000g 4℃離心10min，取上清樣本可直接檢測(cè)，無(wú)需提取處理；活性過(guò)高時(shí)可用生理鹽水稀釋
測(cè)定操作步驟
可見(jiàn)分光光度法操作
試劑準(zhǔn)備：
試劑一：0.1mol/L Tris-HCl緩沖液，pH8.0，4℃保存
試劑二：0.5mmol/L細(xì)胞色素C溶液，-20℃避光保存
試劑三：10mmol/L L-半乳糖內(nèi)酯溶液，-20℃避光保存
試劑四：0.1mol/L EDTA溶液，4℃保存
工作液：試劑一 + 試劑二 + 試劑三 + 試劑四，按體積比100:5:5:2混合，現(xiàn)配現(xiàn)用
預(yù)溫育：
分光光度計(jì)預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到550nm，用蒸餾水調(diào)零
工作液在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（植物）水浴中預(yù)熱10min以上
反應(yīng)啟動(dòng)：
取比色皿，依次加入：工作液950μL + 樣本50μL
混勻，記錄550nm波長(zhǎng)下0min（A1）和1min（A2）時(shí)的吸光度值
計(jì)算ΔA：ΔA = A2 - A1
酶活性計(jì)算：
根據(jù)ΔA值，按照公式計(jì)算Gal LDH活性
微量法（酶標(biāo)儀）操作96孔板每孔加入：工作液95μL + 樣本5μL37℃預(yù)溫育5min，加入樣本后立即混勻設(shè)置動(dòng)力學(xué)模式，550nm處連續(xù)讀取10個(gè)循環(huán)（每1min讀取1次）計(jì)算吸光度增加速率（ΔA/min）
酶活力計(jì)算方法
單位定義
U/g鮮重：每g組織鮮重每分鐘催化1μmol底物反應(yīng)的酶量
U/mL：每mL樣本每分鐘催化1μmol底物反應(yīng)的酶量
U/mgprot：每mg蛋白每分鐘催化1μmol底物反應(yīng)的酶量
計(jì)算公式
Gal LDH活性(U/mgprot)=ΔA×V反總×V樣總ε×d×Cpr×V樣測(cè)×TGal LDH活性(U/mgprot)=ε×d×Cpr×V樣測(cè)×TΔA×V反總×V樣總
ΔA：1min內(nèi)吸光度變化值
V反總：反應(yīng)體系總體積（1.0mL）
V樣總：樣本提取液總體積（mL）
ε：還原型細(xì)胞色素C摩爾消光系數(shù)（2.1×10? L/(mol·cm)）
d：比色皿光徑（1cm）
Cpr：樣本蛋白濃度（mg/mL）
V樣測(cè)：測(cè)定時(shí)加入樣本體積（0.05mL）
T：反應(yīng)時(shí)間（1min）
簡(jiǎn)化公式
組織樣本：Gal LDH（U/g鮮重）= 0.238 × ΔA ÷ W
液體樣本：Gal LDH（U/mL）= 0.238 × ΔA
蛋白樣本：Gal LDH（U/mgprot）= 0.238 × ΔA ÷ Cpr
性能指標(biāo)
指標(biāo) 要求
線性范圍 0~100U/mL，線性相關(guān)系數(shù)r≥0.995
最低檢測(cè)限 ≤0.5U/mL
回收率 90%~110%
批內(nèi)精密度 CV≤5.0%
批間精密度 CV≤8.0%
穩(wěn)定性 4℃保存12個(gè)月，活性保留≥90%
注意事項(xiàng)
樣本處理：
樣本需新鮮制備，避免酶失活；-80℃可保存1個(gè)月
勻漿與超聲破碎需在冰浴中進(jìn)行，控制溫度在0-4℃
樣本需避免氧化，處理過(guò)程中盡量減少與空氣接觸
試劑使用：
L-半乳糖內(nèi)酯溶液對(duì)光敏感，配制后需避光保存
細(xì)胞色素C溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免氧化
不同批號(hào)試劑不能混用，需重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
測(cè)定過(guò)程：
反應(yīng)溫度需嚴(yán)格控制在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（植物）
若ΔA值大于0.3，需稀釋樣本后重新測(cè)定
每個(gè)樣本需設(shè)置平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值
質(zhì)量控制：
每次實(shí)驗(yàn)需設(shè)置空白對(duì)照和質(zhì)控樣本
定期校準(zhǔn)儀器，確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性
若結(jié)果偏差較大，需檢查試劑是否變質(zhì)或樣本處理是否正確
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關(guān)鍵字： L半乳糖酸1,4內(nèi)酯脫氫酶;Gal LDH;測(cè)試盒;
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