商品屬性
產(chǎn)品名稱 | 硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶（TPX）測(cè)試盒 | 產(chǎn)品貨號(hào) | BH-961131 |
規(guī)格 | 100管/96樣、50管/48樣 | 產(chǎn)品分類 | 谷胱甘肽系列 |
測(cè)試方法 | 微量法、紫外分光光度法 | 用途 | 僅供科研實(shí)驗(yàn) |
測(cè)定意義與原理
測(cè)定意義
硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶（TPX）屬于過(guò)氧化物酶家族，在體內(nèi)主要通過(guò)還原過(guò)氧化氫和一些氫過(guò)氧化物來(lái)實(shí)現(xiàn)抗氧化作用，功能與GPX類似，也是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)關(guān)鍵酶之一。TPX普遍存在于各種生物體內(nèi)，酵母、植物、動(dòng)物、原生動(dòng)物、寄生蟲(chóng)甚至細(xì)菌和古細(xì)菌體內(nèi)都含有該酶，在進(jìn)化上高度保守。TPX與細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞凋亡及發(fā)生調(diào)控密切相關(guān)。TPX的主要功能包括細(xì)胞脫毒、抗氧化和調(diào)節(jié)由過(guò)氧化氫介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫反應(yīng)。
測(cè)定原理
TPX催化H?O?氧化二硫蘇糖醇(DTT)，H?O?的吸收波長(zhǎng)為240nm，通過(guò)測(cè)定240nm波長(zhǎng)處吸光度的下降速率，即可計(jì)算出TPX活性。 H2O2+DTT→TPXH2O+ox-DTTH2O2+DTTTPXH2O+ox-DTT
自備儀器與試劑
必備儀器
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀（240nm檢測(cè)通道）
低溫離心機(jī)（≥8000g）
水浴鍋（控溫精度±0.5℃）
可調(diào)節(jié)移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）
超聲破碎儀（用于細(xì)胞/細(xì)菌樣本）
必備耗材
1mL石英比色皿/96孔板
離心管（1.5mL、10mL）
一次性無(wú)菌吸頭
研缽/組織勻漿器（冰浴專用）
自備試劑
蒸餾水/雙蒸水
生理鹽水（0.85% NaCl）
液氮（用于樣本速凍）
樣本前處理方法
動(dòng)植物組織樣本取新鮮組織，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一進(jìn)行冰浴勻漿8000g 4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)若酶活性過(guò)高，可用提取液稀釋1-5倍后測(cè)定
細(xì)菌/真菌樣本收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞/細(xì)菌，8000g 4℃離心5min棄上清按照細(xì)胞數(shù)量(10?個(gè)):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）8000g 4℃離心10min，取上清置于冰上待測(cè)
血清/血漿樣本血清樣本：血液凝固后3000g 4℃離心10min，取血清上清血漿樣本：加入抗凝劑（肝素/EDTA）后3000g 4℃離心10min，取上清樣本可直接檢測(cè)，無(wú)需提取處理；活性過(guò)高時(shí)可用生理鹽水稀釋
測(cè)定操作步驟
紫外分光光度法操作
試劑準(zhǔn)備：
試劑一：液體5mL×1瓶，4℃保存
試劑二：液體1.5mL×1支，-20℃保存
試劑三：粉劑×1支，4℃保存；臨用前加入1.6mL雙蒸水，混勻，4℃保存一周
檢測(cè)工作液：試劑一1.0mL + 試劑二50μL + 試劑三50μL，現(xiàn)配現(xiàn)用
檢測(cè)工作液置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴中預(yù)熱10min以上
預(yù)溫育：
分光光度計(jì)預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到240nm，用蒸餾水調(diào)零
試劑一和試劑二置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）預(yù)熱30min以上
反應(yīng)啟動(dòng)：
CAT活性測(cè)定管：取1mL石英比色皿，加入20μL上清液，900μL試劑一，80μL試劑三，迅速混勻后于240nm測(cè)定10s和130s吸光度，分別為A1和A2，計(jì)算ΔA_CAT = A1 - A2
總活性測(cè)定管：取1mL石英比色皿，加入20μL上清液，900μL試劑二，80μL試劑三，迅速混勻后于240nm測(cè)定10s和130s吸光度，分別為A3和A4，計(jì)算ΔA_總 = A3 - A4
TPX活性ΔA：ΔA_TPX = ΔA_總 - ΔA_CAT
微量法（酶標(biāo)儀）操作96孔板每孔加入：工作液90μL + 樣本10μL37℃預(yù)溫育5min，加入樣本后立即混勻設(shè)置動(dòng)力學(xué)模式，240nm處連續(xù)讀取10個(gè)循環(huán)（每1min讀取1次）計(jì)算吸光度下降速率（ΔA/min）
酶活力計(jì)算方法
單位定義
U/g鮮重：每g組織鮮重每分鐘分解1μmol H?O?的酶量
U/mL：每mL樣本每分鐘分解1μmol H?O?的酶量
U/mgprot：每mg蛋白每分鐘分解1μmol H?O?的酶量
計(jì)算公式
TPX活性(U/mgprot)=ΔA×V反總×V樣總ε×d×Cpr×V樣測(cè)×TTPX活性(U/mgprot)=ε×d×Cpr×V樣測(cè)×TΔA×V反總×V樣總
ΔA：120s內(nèi)吸光度變化值
V反總：反應(yīng)體系總體積（1.0mL）
V樣總：樣本提取液總體積（mL）
ε：H?O?摩爾消光系數(shù)（43.6 L/(mol·cm)）
d：比色皿光徑（1cm）
Cpr：樣本蛋白濃度（mg/mL）
V樣測(cè)：測(cè)定時(shí)加入樣本體積（0.02mL）
T：反應(yīng)時(shí)間（2min）
簡(jiǎn)化公式
組織樣本：TPX（U/g鮮重）= 1.148 × ΔA ÷ W
液體樣本：TPX（U/mL）= 1.148 × ΔA
蛋白樣本：TPX（U/mgprot）= 1.148 × ΔA ÷ Cpr
注意事項(xiàng)
樣本處理：
樣本需新鮮制備，避免酶失活；-80℃可保存1個(gè)月
勻漿與超聲破碎需在冰浴中進(jìn)行，控制溫度在0-4℃
樣本需避免氧化，處理過(guò)程中盡量減少與空氣接觸
試劑使用：
試劑三配制后需避光保存，4℃可穩(wěn)定一周
檢測(cè)工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免氧化
不同批號(hào)試劑不能混用，需重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
測(cè)定過(guò)程：
反應(yīng)溫度嚴(yán)格控制在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（植物）
若ΔA值大于0.3，需稀釋樣本后重新測(cè)定
每個(gè)樣本需設(shè)置3個(gè)平行孔，取平均值計(jì)算
質(zhì)量控制：
每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照（提取液替代樣本）和陽(yáng)性對(duì)照
若結(jié)果偏差較大，需檢查試劑是否變質(zhì)、樣本處理是否正確
正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定
公司正在出售的產(chǎn)品
基質(zhì)金屬蛋白組織抑制因子1檢測(cè)試劑盒 TIMP-1 ELISA Kit | GC-2 SPd(ts)小鼠精母細(xì)胞系 |
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人棕櫚酰化膜蛋白2ELISA試劑盒 | 人原代軟骨細(xì)胞 |
人游離三碘甲狀腺原氨SUANELISA試劑盒 | 人軟骨細(xì)胞 |
人游離血紅蛋白ELISA試劑盒 | 小鼠小腸內(nèi)分泌細(xì)胞系STC-1 （種屬鑒定） |
關(guān)鍵字： 硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶;TPX;測(cè)試盒;
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派瑞曼pyram?除包括化學(xué)、分析化學(xué)、生命科學(xué)、材料科學(xué)和病理科學(xué)產(chǎn)品。質(zhì)量是所有產(chǎn)品和服務(wù)最關(guān)鍵的組成部分,我們通過(guò)質(zhì)量和實(shí)力贏得客戶的信賴。產(chǎn)品的質(zhì)量是企業(yè)的生命。
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