商品屬性
產(chǎn)品名稱 | 脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）測試盒 | 產(chǎn)品貨號 | BH-961144 |
規(guī)格 | 100管/96樣、50管/48樣 | 產(chǎn)品分類 | 維生素C代謝系列 |
測試方法 | 微量法、紫外分光光度法 | 用途 | 僅供科研實驗 |
測定意義與原理
測定意義
脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR，EC1.8.5.1）是抗壞血酸（AsA）-谷胱甘肽（GSH）循環(huán)中的關(guān)鍵酶，主要功能包括：抗壞血酸再生：催化脫氫抗壞血酸（DHA）還原為AsA，維持細胞內(nèi)AsA的水平抗氧化防御：清除活性氧，保護細胞膜免受氧化損傷信號轉(zhuǎn)導：參與氧化還原信號傳導，調(diào)節(jié)細胞生長、發(fā)育和應(yīng)激響應(yīng)品質(zhì)調(diào)控：影響農(nóng)產(chǎn)品的抗氧化能力和貯藏保鮮期
測定原理
DHAR催化GSH還原DHA為AsA，同時GSH被氧化為GSSG，通過測定340nm處GSH的氧化速率（吸光度下降速率），計算DHAR活性。反應(yīng)式如下： DHA+2GSH→DHARAsA+GSSGDHA+2GSHDHARAsA+GSSG
試劑盒組成
組分 規(guī)格 作用說明
試劑一 50mL×1瓶/100mL×1瓶 含0.1mol/L Tris-HCl緩沖液，pH7.0，用于反應(yīng)體系構(gòu)建
試劑二 10mL×1瓶/20mL×1瓶 含10mmol/L脫氫抗壞血酸（DHA），反應(yīng)底物
試劑三 10mL×1瓶/20mL×1瓶 含20mmol/L還原型谷胱甘肽（GSH），電子供體
試劑四 5mL×1瓶/10mL×1瓶 含0.1mol/L EDTA，金屬離子螯合劑
標準品 1×100U 用于校準儀器，建立標準曲線
提取液 100mL×1瓶 含0.1mol/L Tris-HCl緩沖液，pH7.4，用于樣本提取
自備儀器與試劑
必備儀器
紫外/可見分光光度計/酶標儀（340nm檢測通道）
低溫離心機（≥8000g）
恒溫水浴鍋（控溫精度±0.5℃）
可調(diào)式移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）
研缽/組織勻漿器（冰浴專用）
必備耗材
1mL石英比色皿/96孔板
離心管（1.5mL、10mL）
一次性無菌吸頭
手術(shù)剪/鑷子（用于組織樣本處理）
自備試劑
蒸餾水/去離子水
生理鹽水（0.85% NaCl）
抗凝劑（肝素/EDTA，僅用于血漿樣本）
樣本前處理方法
動植物組織樣本取新鮮組織，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分稱取約0.1g組織，加入1mL預冷提取液，冰浴勻漿8000g 4℃離心10min，取上清液置冰上待測若酶活性過高，可用提取液稀釋1-5倍后測定
細菌/細胞樣本收集對數(shù)生長期細菌/細胞，8000g 4℃離心5min棄上清按照細菌或細胞數(shù)量(10?個):提取液體積(mL)=500~1000:1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率20%或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）8000g 4℃離心10min，取上清液置冰上待測
血清/血漿樣本血清樣本：血液凝固后3000g 4℃離心10min，取血清上清血漿樣本：加入抗凝劑（肝素/EDTA）后3000g 4℃離心10min，取上清樣本可直接檢測，無需提取處理；活性過高時可用生理鹽水稀釋
測定操作步驟
紫外分光光度法操作
試劑準備：
試劑一：0.1mol/L Tris-HCl緩沖液，pH7.0，4℃保存
試劑二：10mmol/L脫氫抗壞血酸（DHA）溶液，-20℃避光保存
試劑三：20mmol/L還原型谷胱甘肽（GSH）溶液，-20℃避光保存
試劑四：0.1mol/L EDTA溶液，4℃保存
工作液：試劑一 + 試劑二 + 試劑三 + 試劑四，按體積比100:5:5:2混合，現(xiàn)配現(xiàn)用
預溫育：
分光光度計預熱30min，調(diào)節(jié)波長到340nm，用蒸餾水調(diào)零
工作液在37℃（哺乳動物）或25℃（植物）水浴中預熱10min以上
反應(yīng)啟動：
取比色皿，依次加入：工作液950μL + 樣本50μL
混勻，記錄340nm波長下0min（A1）和1min（A2）時的吸光度值
計算ΔA：ΔA = A1 - A2
酶活性計算：
根據(jù)ΔA值，按照公式計算DHAR活性
微量法（酶標儀）操作96孔板每孔加入：工作液95μL + 樣本5μL37℃預溫育5min，加入樣本后立即混勻設(shè)置動力學模式，340nm處連續(xù)讀取10個循環(huán)（每1min讀取1次）計算吸光度下降速率（ΔA/min）
酶活力計算方法
單位定義
U/g鮮重：每g組織鮮重每分鐘催化1μmol底物反應(yīng)的酶量
U/mL：每mL樣本每分鐘催化1μmol底物反應(yīng)的酶量
U/mgprot：每mg蛋白每分鐘催化1μmol底物反應(yīng)的酶量
計算公式
DHAR活性(U/mgprot)=ΔA×V反總×V樣總ε×d×Cpr×V樣測×TDHAR活性(U/mgprot)=ε×d×Cpr×V樣測×TΔA×V反總×V樣總
ΔA：1min內(nèi)吸光度變化值
V反總：反應(yīng)體系總體積（1.0mL）
V樣總：樣本提取液總體積（mL）
ε：GSH摩爾消光系數(shù)（6.22×103 L/(mol·cm)）
d：比色皿光徑（1cm）
Cpr：樣本蛋白濃度（mg/mL）
V樣測：測定時加入樣本體積（0.05mL）
T：反應(yīng)時間（1min）
簡化公式
組織樣本：DHAR（U/g鮮重）= 0.322 × ΔA ÷ W
液體樣本：DHAR（U/mL）= 0.322 × ΔA
蛋白樣本：DHAR（U/mgprot）= 0.322 × ΔA ÷ Cpr
性能指標
指標 要求
線性范圍 0~100U/mL，線性相關(guān)系數(shù)r≥0.995
最低檢測限 ≤0.5U/mL
回收率 90%~110%
批內(nèi)精密度 CV≤5.0%
批間精密度 CV≤8.0%
穩(wěn)定性 4℃保存12個月，活性保留≥90%
注意事項
樣本處理：
樣本需新鮮制備，避免酶失活；-80℃可保存1個月
勻漿與超聲破碎需在冰浴中進行，控制溫度在0-4℃
樣本需避免氧化，處理過程中盡量減少與空氣接觸
試劑使用：
脫氫抗壞血酸（DHA）溶液對光敏感，配制后需避光保存
還原型谷胱甘肽（GSH）溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免氧化
不同批號試劑不能混用，需重新繪制標準曲線
測定過程：
反應(yīng)溫度需嚴格控制在37℃（哺乳動物）或25℃（植物）
若ΔA值大于0.3，需稀釋樣本后重新測定
每個樣本需設(shè)置平行實驗，結(jié)果取平均值
質(zhì)量控制：
每次實驗需設(shè)置空白對照和質(zhì)控樣本
定期校準儀器，確保檢測結(jié)果準確性
若結(jié)果偏差較大，需檢查試劑是否變質(zhì)或樣本處理是否正確
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關(guān)鍵字： 脫氫抗壞血酸還原酶;DHAR;測試盒;
派瑞曼pyram?是上海博湖生物科技有限公司（Shanghai Bohu Biological Technology Co., Ltd.，China）的產(chǎn)品品牌。
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