果糖1,6二磷酸醛縮酶(FBA)測(cè)試盒
測(cè)定意義與原理
測(cè)定意義
FBA（EC4.1.2.13）是糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，其活性檢測(cè)具有重要意義：臨床診斷：診斷和監(jiān)測(cè)肌肉疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病等疾病監(jiān)測(cè)：評(píng)估細(xì)胞能量代謝狀態(tài)、組織損傷程度和治療效果生物學(xué)研究：了解糖酵解途徑、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖機(jī)制藥物研發(fā)：篩選糖酵解途徑抑制劑，用于治療癌癥和代謝疾病植物學(xué)研究：研究植物光合作用、碳代謝途徑、抗逆性機(jī)制
測(cè)定原理
分光光度法/微量法：FBA催化果糖1,6-二磷酸生成3-磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮，在磷酸丙糖異構(gòu)酶和α-磷酸甘油脫氫酶作用下催化NADH和磷酸二羥丙酮生成NAD和α-磷酸甘油，通過(guò)測(cè)定340nm處吸光度變化，計(jì)算FBA活性。反應(yīng)式如下： 果糖1,6-二磷酸→FBA3-磷酸甘油醛+磷酸二羥丙酮果糖1,6-二磷酸FBA3-磷酸甘油醛+磷酸二羥丙酮 磷酸二羥丙酮+NADH+H+→磷酸丙糖異構(gòu)酶/α-磷酸甘油脫氫酶α-磷酸甘油+NAD+磷酸二羥丙酮+NADH+H+磷酸丙糖異構(gòu)酶/α-磷酸甘油脫氫酶α-磷酸甘油+NAD+
ELISA法：利用特異性抗體與FBA結(jié)合，通過(guò)酶標(biāo)二抗檢測(cè)結(jié)合的FBA，根據(jù)吸光度值計(jì)算FBA含量。
試劑盒組成
分光光度法/微量法試劑盒
組分 規(guī)格 作用說(shuō)明
提取液一 50mL×1瓶 用于提取總FBA和胞漿FBA
提取液二 50mL×1瓶 用于提取葉綠體FBA
試劑一 液體25mL×1瓶 含緩沖液，用于提供適宜的反應(yīng)pH環(huán)境
試劑二 粉劑×1瓶 含NADH溶液，反應(yīng)底物
試劑三 粉劑×1瓶 含磷酸丙糖異構(gòu)酶和α-磷酸甘油脫氫酶溶液，反應(yīng)輔助因子
試劑四 液體×1瓶 含果糖1,6-二磷酸溶液，反應(yīng)輔助因子
試劑五 液體×1瓶 含MgCl?溶液，反應(yīng)輔助因子
標(biāo)準(zhǔn)品 1mL×1支 含F(xiàn)BA標(biāo)準(zhǔn)液，用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線
ELISA法試劑盒
組分 規(guī)格 作用說(shuō)明
包被板 96孔×1塊 預(yù)包被抗FBA單克隆抗體
酶標(biāo)抗體 液體6mL×1瓶 含HRP標(biāo)記抗FBA抗體
標(biāo)準(zhǔn)品 液體1mL×6管 含0.1-10U/L FBA標(biāo)準(zhǔn)品
樣本稀釋液 10mL×1瓶 用于稀釋樣本和標(biāo)準(zhǔn)品
顯色劑A液 6mL×1瓶 含過(guò)氧化氫溶液
顯色劑B液 6mL×1瓶 含TMB溶液
終止液 6mL×1瓶 含硫酸溶液
20倍濃縮洗滌液 20mL×1瓶 用于洗滌酶標(biāo)板
自備儀器與試劑
必備儀器
分光光度法/微量法：紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、恒溫水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL石英比色皿/96孔板、研缽、電子天平
ELISA法：酶標(biāo)儀（450nm檢測(cè)通道）、96孔板、37℃恒溫箱、洗板機(jī)、可調(diào)式移液器、臺(tái)式離心機(jī)
必備耗材
離心管（1.5mL/10mL）、一次性吸頭、研缽/組織勻漿器、超聲破碎儀
自備試劑：蒸餾水/去離子水、生理鹽水
樣本前處理方法
總FBA酶提取取樣：建議稱取約0.1g樣本，加入1mL提取液一，冰浴勻漿破碎：超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時(shí)間1min）離心：4℃，8000g離心10min，取上清測(cè)定
胞漿和葉綠體FBA酶的分離取樣：按照植物組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5～10的比例（建議稱取約0.1g樣本，加入1mL提取液一），冰浴勻漿分離：4℃，200g離心5min，棄沉淀，取上清在4℃，8000g離心10min，取上清用于測(cè)定胞漿FBA酶活性提取葉綠體FBA：取沉淀加1mL提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時(shí)間1min），然后4℃，8000g離心10min，取上清測(cè)定葉綠體中FBA酶活性
血清/血漿樣本
血清/血漿樣本可直接檢測(cè)；若濃度過(guò)高，用生理鹽水稀釋5-10倍
測(cè)定操作步驟
分光光度法/微量法操作儀器預(yù)熱：分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零試劑配制：
試劑二：臨用前加5mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融
試劑三：臨用前加5mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融樣本測(cè)定：
試劑名稱(μL) 空白管 測(cè)定管
蒸餾水/樣本 100 100
試劑一 500 500
試劑二 100 100
試劑三 100 100
試劑四 100 100
試劑五 100 100
充分混勻，記錄340nm處10s的吸光值A(chǔ)1和310s的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A1-A2
ELISA法操作試劑準(zhǔn)備：將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，室溫平衡15-30分鐘；將20×洗滌緩沖液用蒸餾水20倍稀釋后備用加樣：
從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃
設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；樣本孔中加入待測(cè)樣本50μL；空白孔不加溫育：除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min洗滌：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）顯色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min終止：每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值結(jié)果計(jì)算：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按曲線方程計(jì)算樣本濃度
結(jié)果計(jì)算方法
單位定義
U/mg prot：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH的酶量
U/g 鮮重：每克組織每分鐘消耗1nmol NADH的酶量
U/L：每升樣本每分鐘消耗1nmol NADH的酶量
分光光度法/微量法計(jì)算公式
FBA活性(U/mg prot)=321.54×ΔACprFBA活性(U/mg prot)=Cpr321.54×ΔA FBA活性(U/g 鮮重)=321.54×ΔAWFBA活性(U/g 鮮重)=W321.54×ΔA FBA活性(U/L)=321.54×ΔAV樣FBA活性(U/L)=V樣321.54×ΔA
ΔA：吸光度變化值
Cpr：樣本蛋白濃度（mg/mL）
W：樣本質(zhì)量（g）
V樣：樣本體積（L）
ELISA法計(jì)算公式
FBA含量(U/L)=樣本OD值?空白OD值標(biāo)準(zhǔn)品OD值?空白OD值×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×稀釋倍數(shù)FBA含量(U/L)=標(biāo)準(zhǔn)品OD值?空白OD值樣本OD值?空白OD值×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×稀釋倍數(shù)
性能指標(biāo)
指標(biāo) 分光光度法/微量法 ELISA法
線性范圍 0~50U/L 0.1-10U/L
最低檢測(cè)限 ≤0.1U/L ≤0.05U/L
回收率 90%~110% 90%~110%
批內(nèi)精密度 CV≤1.7% CV≤5.0%
批間精密度 CV≤5.0% CV≤8.0%
穩(wěn)定性 2-8℃保存6-12個(gè)月 2-8℃保存6-12個(gè)月
注意事項(xiàng)
樣本處理：
樣本需新鮮制備，避免FBA失活；-20℃可保存3個(gè)月
組織樣本需冰浴勻漿，避免酶失活
超聲波破碎時(shí)需控制功率和時(shí)間，避免樣本降解
試劑使用：
試劑二、試劑三需臨用前配制，避免氧化失效
工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免試劑失效
不同批號(hào)試劑不能混用，需重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
測(cè)定過(guò)程：
反應(yīng)溫度需嚴(yán)格控制在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）
加入試劑后需充分混勻，確保反應(yīng)完全
若吸光度值超出線性范圍，需稀釋樣本后重新測(cè)定
質(zhì)量控制：
每次實(shí)驗(yàn)需設(shè)置空白對(duì)照和質(zhì)控樣本
定期校準(zhǔn)儀器，確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性
若結(jié)果偏差較大，需檢查試劑是否變質(zhì)或樣本處理是否正確
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關(guān)鍵字： 果糖1,6二磷酸醛縮酶;FBA;測(cè)試盒;
派瑞曼pyram?是上海博湖生物科技有限公司（Shanghai Bohu Biological Technology Co., Ltd.，China）的產(chǎn)品品牌。
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派瑞曼pyram?除包括化學(xué)、分析化學(xué)、生命科學(xué)、材料科學(xué)和病理科學(xué)產(chǎn)品。質(zhì)量是所有產(chǎn)品和服務(wù)最關(guān)鍵的組成部分,我們通過(guò)質(zhì)量和實(shí)力贏得客戶的信賴。產(chǎn)品的質(zhì)量是企業(yè)的生命。
公司秉承"專注品質(zhì)、誠(chéng)信為本、服務(wù)至上、合作共贏"的企業(yè)文化積極參與生物領(lǐng)域的技術(shù)創(chuàng)新和技術(shù)服務(wù),力求為我國(guó)科研事業(yè)更好的,更專業(yè)的服務(wù)！