商品屬性
產(chǎn)品名稱 | 多酚氧化酶(PPO）測試盒 | 產(chǎn)品貨號 | BH-961156 |
規(guī)格 | 100管/48樣、50管/24樣 | 產(chǎn)品分類 | 氧化與抗氧化系列 |
測試方法 | 微量法、可見分光光度法 | 用途 | 僅供科研實驗 |
測定意義與原理
測定意義
多酚氧化酶（PPO，EC1.14.18.1）是一種含銅的氧化還原酶，在生物體內(nèi)具有重要作用：植物抗逆性：參與植物對病原微生物入侵的防御反應(yīng)，形成木質(zhì)素增強細胞壁結(jié)構(gòu)食品褐變：催化酚類物質(zhì)氧化導(dǎo)致食品褐變，影響食品外觀、風味和營養(yǎng)價值生物制藥：可用于生產(chǎn)茶色素、黑色素等天然色素環(huán)境監(jiān)測：作為生物指標評估環(huán)境污染對植物的影響
測定原理
采用鄰苯二酚氧化法，PPO催化鄰苯二酚氧化生成有色的醌類化合物，在420nm處有特征吸收峰，吸光度變化速率與PPO活性成正比。反應(yīng)式如下： 鄰苯二酚+O2→PPO醌類化合物+H2O鄰苯二酚+O2PPO醌類化合物+H2O
試劑盒組成
組分 規(guī)格 作用說明
試劑一 25mL×1瓶/50mL×1瓶 含0.1mol/L磷酸緩沖液，pH6.5，用于反應(yīng)體系構(gòu)建
試劑二 10mL×1瓶/20mL×1瓶 含0.1mol/L鄰苯二酚溶液，反應(yīng)底物
試劑三 100mL×1瓶 含0.1mol/L磷酸緩沖液，pH7.4，用于樣本提取
試劑四 1mL×1支/2mL×1支 含100U PPO標準品，用于建立標準曲線
提取輔助劑 液體10mL×1瓶 含0.1% Triton X-100，用于細胞膜破膜和酶提取
自備儀器與試劑
必備儀器
分光光度計/酶標儀（420nm檢測通道）
低溫離心機（≥8000g）
恒溫水浴鍋（控溫精度±0.5℃）
可調(diào)式移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）
研缽/組織勻漿器（冰浴專用）
必備耗材
1mL玻璃比色皿/96孔板
離心管（1.5mL、10mL）
一次性無菌吸頭
手術(shù)剪/鑷子（用于組織樣本處理）
自備試劑
蒸餾水/去離子水
生理鹽水（0.85% NaCl）
液氮（可選，用于樣本速凍）
樣本前處理方法
動植物組織樣本取新鮮組織，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分稱取約0.1g組織，加入1mL預(yù)冷提取液（試劑三）+ 10μL提取輔助劑，冰浴勻漿8000g 4℃離心15min，取上清液置冰上待測若PPO活性過高，可用提取液稀釋1-10倍后測定
細菌/細胞樣本收集對數(shù)生長期細菌/細胞，8000g 4℃離心5min棄上清按照細菌或細胞數(shù)量(10?個):提取液體積(mL)=500~1000:1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液）+ 10μL提取輔助劑，冰浴超聲波破碎細胞（功率20%或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）8000g 4℃離心15min，取上清液置冰上待測
食品/農(nóng)產(chǎn)品樣本水果/蔬菜：洗凈切塊，加入預(yù)冷提取液（1:5~10W/V），冰浴勻漿茶葉/咖啡豆：研碎后加入預(yù)冷提取液（1:20W/V），冰浴浸泡30min，過濾或離心取上清加工食品：固體食品磨碎后用提取液提取，液體食品直接離心取上清
測定操作步驟
分光光度法操作
試劑準備：
試劑一：液體25mL×1瓶，4℃保存
試劑二：液體10mL×1瓶，-20℃保存，用時加10mL蒸餾水溶解
試劑三：液體100mL×1瓶，4℃保存
工作液：試劑一 + 試劑二，按體積比10:1混合，現(xiàn)配現(xiàn)用
預(yù)溫育：
分光光度計預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長到420nm，蒸餾水調(diào)零
工作液在37℃（哺乳動物）或25℃（植物）水浴中預(yù)熱10min以上
反應(yīng)啟動：
取比色皿，依次加入工作液950μL + 樣本50μL
立即混勻，記錄420nm波長下0min（A1）和1min（A2）時的吸光度值
計算ΔA：ΔA = A2 - A1
微量法（酶標儀）操作96孔板每孔加入：工作液95μL + 樣本5μL25℃預(yù)溫育5min，加入樣本后立即混勻設(shè)置動力學(xué)模式，420nm處連續(xù)讀取10個循環(huán)（每1min讀取1次）計算吸光度上升速率（ΔA/min）
酶活力計算方法
單位定義
U/g鮮重：每克組織鮮重每分鐘催化1μmol鄰苯二酚氧化的酶量
U/mL：每毫升樣本每分鐘催化1μmol鄰苯二酚氧化的酶量
U/mgprot：每毫克蛋白每分鐘催化1μmol鄰苯二酚氧化的酶量
計算公式
PPO活性(U/mgprot)=ΔA×V反總×V樣總ε×d×Cpr×V樣測×TPPO活性(U/mgprot)=ε×d×Cpr×V樣測×TΔA×V反總×V樣總
ΔA：1min內(nèi)吸光度變化值
V反總：反應(yīng)體系總體積（1.0mL）
V樣總：樣本提取液總體積（mL）
ε：醌類產(chǎn)物摩爾消光系數(shù)（0.0037 L/(μmol·cm)）
d：比色皿光徑（1cm）
Cpr：樣本蛋白濃度（mg/mL）
V樣測：測定時加入樣本體積（0.05mL）
T：反應(yīng)時間（1min）
簡化公式
按鮮重計算：PPO（U/g鮮重）= 53.76 × ΔA ÷ W
按液體體積計算：PPO（U/mL）= 53.76 × ΔA
按蛋白含量計算：PPO（U/mgprot）= 53.76 × ΔA ÷ Cpr
性能指標
指標 要求
線性范圍 0~50U/mL，線性相關(guān)系數(shù)r≥0.995
最低檢測限 ≤0.1U/mL
回收率 90%~110%
批內(nèi)精密度 CV≤5.0%
批間精密度 CV≤8.0%
穩(wěn)定性 4℃保存12個月，活性保留≥90%
注意事項
樣本處理：
樣本需新鮮制備，PPO在低溫下活性穩(wěn)定，但反復(fù)凍融會導(dǎo)致活性下降
勻漿與超聲破碎需在冰浴中進行，控制溫度在0-4℃
樣本提取后應(yīng)立即測定，避免酶失活
試劑使用：
鄰苯二酚溶液對光敏感，配制后需避光保存，一周內(nèi)用完
不同批號試劑不能混用，需重新繪制標準曲線
工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用，室溫下放置時間不超過2小時
測定過程：
反應(yīng)溫度需嚴格控制：植物樣本25℃，哺乳動物37℃
若ΔA值大于0.2，需稀釋樣本后重新測定
每個樣本需設(shè)置至少3個平行實驗，結(jié)果取平均值
質(zhì)量控制：
每次實驗需設(shè)置空白對照和質(zhì)控樣本
定期校準儀器，確保檢測結(jié)果準確性
若結(jié)果偏差較大，需檢查試劑是否變質(zhì)或樣本處理是否正確
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關(guān)鍵字： 多酚氧化酶;PPO;測試盒;
派瑞曼pyram?是上海博湖生物科技有限公司（Shanghai Bohu Biological Technology Co., Ltd.，China）的產(chǎn)品品牌。
派瑞曼pyram?是一家化學(xué)、生化和材料科學(xué)等領(lǐng)域的科研用研發(fā)產(chǎn)品的制造商和供應(yīng)商,我們的產(chǎn)品在相當寬的基礎(chǔ)科學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。 客戶包括學(xué)術(shù)界、工業(yè)界和政府的研究和開發(fā)實驗室以及制藥、生物技術(shù)、化工/石化行業(yè)等具商業(yè)規(guī)模的企業(yè)。
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