胃蛋白酶測試盒

測定意義與原理

測定意義

胃蛋白酶（Pepsin）是胃黏膜分泌的一種消化酶，主要用于分解蛋白質，其活性或含量檢測具有重要意義：臨床診斷：診斷和監(jiān)測胃黏膜疾病、消化性潰瘍、胃癌等疾病監(jiān)測：評估胃功能、胃酸分泌狀態(tài)和治療效果生物學研究：了解消化生理、細胞凋亡和細胞增殖機制藥物研發(fā)：篩選抗酸藥物、胃黏膜保護劑等食品工業(yè)：評估食品中蛋白質的消化率和質量

測定原理

福林酚法/比色法/微量法：胃蛋白酶在酸性條件下水解酪蛋白生成酪氨酸，酪氨酸與福林酚試劑反應生成藍色化合物，660nm處的吸光度變化反映了胃蛋白酶的活性高低。反應式如下： 酪蛋白→胃蛋白酶酪氨酸+其他氨基酸酪蛋白胃蛋白酶酪氨酸+其他氨基酸 酪氨酸+福林酚試劑→藍色化合物酪氨酸+福林酚試劑→藍色化合物

ELISA法/化學發(fā)光法：利用特異性抗體與胃蛋白酶結合，通過酶標二抗或化學發(fā)光標記物檢測結合的胃蛋白酶，根據(jù)吸光度值或發(fā)光強度計算胃蛋白酶含量。

試劑盒組成

福林酚法/比色法/微量法試劑盒

組分 規(guī)格 作用說明

勻漿介質 液體60mL×2瓶 用于提取樣本中的胃蛋白酶

試劑一 液體24mL×1瓶 含反應緩沖液，用于提供適宜的反應pH環(huán)境

試劑二 液體6mL×2瓶 含酪蛋白溶液，反應底物

試劑三 液體100mL×1瓶 含福林酚溶液，顯色劑

試劑四 液體9mL×2瓶 含終止液，用于終止反應

標準品 1mL×1支 含酪氨酸標準液，用于建立標準曲線

ELISA法試劑盒

組分 規(guī)格 作用說明

包被板 96孔×1塊 預包被抗胃蛋白酶單克隆抗體

酶標抗體 液體6mL×1瓶 含HRP標記抗胃蛋白酶抗體

標準品 液體1mL×6管 含0.156-10ng/mL胃蛋白酶標準品

樣本稀釋液 10mL×1瓶 用于稀釋樣本和標準品

顯色劑A液 6mL×1瓶 含過氧化氫溶液

顯色劑B液 6mL×1瓶 含TMB溶液

終止液 6mL×1瓶 含硫酸溶液

20倍濃縮洗滌液 20mL×1瓶 用于洗滌酶標板

自備儀器與試劑

必備儀器

福林酚法/比色法/微量法：紫外分光光度計/可見分光光度計、1mL玻璃比色皿/96孔板、臺式離心機、恒溫水浴鍋、可調式移液器、研缽、電子天平

ELISA法：酶標儀（450nm檢測通道）、96孔板、37℃恒溫箱、洗板機、可調式移液器、臺式離心機

化學發(fā)光法：半自動或全自動微孔板式化學發(fā)光檢測儀、96孔板、37℃恒溫箱、洗板機、可調式移液器、臺式離心機

必備耗材

離心管（1.5mL/10mL）、一次性吸頭、研缽/組織勻漿器、超聲破碎儀

自備試劑：蒸餾水/去離子水、生理鹽水

樣本前處理方法

胃液樣本預試：先做預試，再根據(jù)活力大小或直接取胃液進行檢測或用勻漿介質進行適當稀釋后再測離心：取胃液，2500轉/分離心10分鐘，取上清進行檢測

組織樣本取樣：準確稱取組織重量(不要超過0.2g)，按重量體積比加9倍體積的勻漿介質勻漿離心：2500轉/分離心10分鐘，取上清即10%的勻漿，進行預試后根據(jù)活力大小或直接進行檢測或用勻漿介質進行適當稀釋后再測

血清/血漿樣本

血清/血漿樣本可直接檢測；若濃度過高，用生理鹽水稀釋5-10倍

測定操作步驟

福林酚法/比色法/微量法操作樣本及試劑在測試前均要平衡至室溫(室溫在20℃以上可放置室溫;室溫在20℃以下可將試劑置于37℃水浴中預溫10分鐘)樣本測定：

試劑名稱(μL) 測定管 測定空白管*

樣本 40 40

37℃水浴預溫2分鐘 37℃水浴預溫2分鐘 37℃水浴預溫2分鐘

試劑一 -- 400

試劑二 200 200

試劑一 400 --

充分混勻，37℃水浴10分鐘，3500轉/分離心10分鐘，取上清進行顯色反應顯色反應：

試劑名稱(μL) 標準管 標準空白管 測定管 測定空白管*

50ug/ml標準應用液 300 -- -- --

標準品稀釋液 -- 300 -- --

上清 -- -- 300 300

試劑四 300 300 300 300

充分混勻，37℃水浴20分鐘后取出，660nm，1光徑，蒸餾水調零，比色 注：*測定空白管因不同的樣本之間有差距，所以要求每只樣本都要做自身測定空白管；而標準及標準空白管只需各做1-2只

ELISA法操作試劑準備：將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，室溫平衡15-30分鐘；將20×洗滌緩沖液用蒸餾水20倍稀釋后備用加樣：

從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃

設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加溫育：除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入HRP標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min洗滌：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）顯色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min終止：每孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔的OD值結果計算：繪制標準曲線，按曲線方程計算樣本濃度

結果計算方法

單位定義

U/mL：每毫升樣本每分鐘生成1μg酪氨酸的酶量

U/mg prot：每毫克組織蛋白每分鐘生成1μg酪氨酸的酶量

ng/mL：每毫升樣本中胃蛋白酶的含量

福林酚法/比色法/微量法計算公式

胃蛋白酶活力(U/mL)=(A測定?A空白)(A標準?A標準空白)×標準品濃度×V總V樣×反應時間×稀釋倍數(shù)胃蛋白酶活力(U/mL)=(A標準?A標準空白)(A測定?A空白)×標準品濃度×V樣V總×反應時間×稀釋倍數(shù) 胃蛋白酶活力(U/mg prot)=(A測定?A空白)(A標準?A標準空白)×標準品濃度×V總V樣×反應時間×稀釋倍數(shù)÷勻漿蛋白含量胃蛋白酶活力(U/mg prot)=(A標準?A標準空白)(A測定?A空白)×標準品濃度×V樣V總×反應時間×稀釋倍數(shù)÷勻漿蛋白含量

A測定：測定管吸光度值

A空白：測定空白管吸光度值

A標準：標準管吸光度值

A標準空白：標準空白管吸光度值

V總：反應總體積（mL）

V樣：取樣量（mL）

反應時間：10min

ELISA法計算公式

胃蛋白酶含量(ng/mL)=樣本OD值?空白OD值標準品OD值?空白OD值×標準品濃度×稀釋倍數(shù)胃蛋白酶含量(ng/mL)=標準品OD值?空白OD值樣本OD值?空白OD值×標準品濃度×稀釋倍數(shù)

性能指標

指標 福林酚法/比色法/微量法 ELISA法/化學發(fā)光法

線性范圍 0~18U/L 0.156-10ng/mL

最低檢測限 ≤1.2U/L ≤0.078ng/mL

回收率 90%~110% 90%~110%

批內精密度 CV≤8.3% CV≤5.0%

批間精密度 CV≤10% CV≤8.0%

穩(wěn)定性 2-8℃保存6-12個月 2-8℃保存6-12個月

注意事項

樣本處理：

樣本需新鮮制備，避免胃蛋白酶失活；-20℃可保存3個月

組織樣本需冰浴勻漿，避免酶失活

液體樣本需避免溶血和細菌污染

試劑使用：

試劑需臨用前配制，避免氧化失效

不同批號試劑不能混用，需重新繪制標準曲線

標準品需4℃保存，避免反復凍融

測定過程：

反應溫度需嚴格控制在37℃

加入樣品啟動反應后3秒內即刻比色測定

若吸光度值超出線性范圍，需稀釋樣本后重新測定

質量控制：

每次實驗需設置空白對照和質控樣本

定期校準儀器，確保檢測結果準確性

若結果偏差較大，需檢查試劑是否變質或樣本處理是否正確

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