游離脂肪酸含量（FFA）測(cè)試盒

測(cè)定意義與原理

測(cè)定意義

游離脂肪酸（FFA）既是脂肪水解的產(chǎn)物，又是脂肪合成的底物，在與白蛋白結(jié)合的血漿中循環(huán)。其濃度與脂類代謝、糖代謝、內(nèi)分泌功能有關(guān)，也可反映食物貯藏中的品質(zhì)變化：臨床診斷：診斷和監(jiān)測(cè)糖尿病、重癥肝障礙、甲狀腺功能亢進(jìn)、肥胖癥等疾病疾病監(jiān)測(cè)：評(píng)估脂肪代謝狀態(tài)、胰島素抵抗程度和治療效果生物學(xué)研究：了解脂肪代謝、糖代謝和細(xì)胞能量代謝機(jī)制食品安全：評(píng)估食品品質(zhì)、新鮮度和貯藏條件農(nóng)業(yè)應(yīng)用：研究植物抗逆性機(jī)制、果實(shí)成熟過程等

測(cè)定原理

分光光度法/微量法：在弱酸性條件下，F(xiàn)FA與銅鹽反應(yīng)生成銅皂，在715nm處有特征吸收峰，在一定范圍內(nèi)游離脂肪酸含量與顯色程度呈線性關(guān)系。

ELISA法：采用雙抗體夾心法，將游離脂肪酸與特異性抗體結(jié)合，通過酶標(biāo)二抗檢測(cè)結(jié)合的游離脂肪酸，根據(jù)吸光度值計(jì)算游離脂肪酸含量。

試劑盒組成

分光光度法/微量法試劑盒

組分 規(guī)格 作用說明

提取液 液體60mL×1瓶 用于提取樣本中的FFA

試劑一 液體45mL×1瓶 含反應(yīng)緩沖液，用于提供適宜的反應(yīng)pH環(huán)境

試劑二 粉劑×1瓶 含銅鹽溶液，反應(yīng)底物

試劑三 粉劑×1瓶 含顯色液，反應(yīng)輔助因子

標(biāo)準(zhǔn)品 1mL×1支 含F(xiàn)FA標(biāo)準(zhǔn)液，用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

ELISA法試劑盒

組分 規(guī)格 作用說明

包被板 96孔×1塊 預(yù)包被抗FFA單克隆抗體

酶標(biāo)抗體 液體6mL×1瓶 含HRP標(biāo)記抗FFA抗體

標(biāo)準(zhǔn)品 液體1mL×6管 含0.1-10U/L FFA標(biāo)準(zhǔn)品

樣本稀釋液 10mL×1瓶 用于稀釋樣本和標(biāo)準(zhǔn)品

顯色劑A液 6mL×1瓶 含過氧化氫溶液

顯色劑B液 6mL×1瓶 含TMB溶液

終止液 6mL×1瓶 含硫酸溶液

20倍濃縮洗滌液 20mL×1瓶 用于洗滌酶標(biāo)板

自備儀器與試劑

必備儀器

分光光度法/微量法：紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、恒溫水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL石英比色皿/96孔板、研缽、電子天平

ELISA法：酶標(biāo)儀（450nm檢測(cè)通道）、96孔板、37℃恒溫箱、洗板機(jī)、可調(diào)式移液器、臺(tái)式離心機(jī)

必備耗材

離心管（1.5mL/10mL）、一次性吸頭、研缽/組織勻漿器、超聲破碎儀

自備試劑：蒸餾水/去離子水、生理鹽水

樣本前處理方法

血清/血漿樣本采集：采集血液，靜置1-2小時(shí)（血清）或使用抗凝劑（血漿）離心：3000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)

動(dòng)植物組織樣本取樣：按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿離心：8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)

細(xì)胞/微生物樣本收集：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清破碎：按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10?個(gè)）:提取液體積(mL)為500~1000:1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20%或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）離心：8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)

測(cè)定操作步驟

分光光度法/微量法操作儀器預(yù)熱：分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到715nm，蒸餾水調(diào)零試劑配制：

試劑二：臨用前加入1.5mL蒸餾水充分溶解備用

試劑三：臨用前加入1.5mL蒸餾水充分溶解備用樣本測(cè)定：

試劑名稱(μL) 空白管 測(cè)定管

蒸餾水/樣本 100 100

試劑一 700 700

試劑二 100 100

試劑三 100 100

混勻后立即記錄715nm處反應(yīng)5min時(shí)的吸光值A(chǔ)1和10min時(shí)的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A2-A1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：將FFA標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成0、10、20、30、40、50U/L系列濃度，同樣處理，測(cè)定10min內(nèi)吸光度變化，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

ELISA法操作試劑準(zhǔn)備：將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，室溫平衡15-30分鐘；將20×洗滌緩沖液用蒸餾水20倍稀釋后備用加樣：

從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃

設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；樣本孔中加入待測(cè)樣本50μL；空白孔不加溫育：除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min洗滌：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）顯色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min終止：每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值結(jié)果計(jì)算：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按曲線方程計(jì)算樣本濃度

結(jié)果計(jì)算方法

單位定義

μmol/L：每升樣本中FFA的含量

μmol/g 鮮重：每克組織中FFA的含量

μmol/mg prot：每毫克組織蛋白中FFA的含量

分光光度法/微量法計(jì)算公式

FFA含量(μmol/L)=ΔA×V總ε×d×V樣×106FFA含量(μmol/L)=ε×d×V樣ΔA×V總×106

ΔA：吸光度變化值

V總：反應(yīng)體系總體積（L）

ε：摩爾消光系數(shù)（L/mol/cm）

d：比色皿光徑（cm）

V樣：樣本體積（L）

ELISA法計(jì)算公式

FFA含量(U/L)=樣本OD值?空白OD值標(biāo)準(zhǔn)品OD值?空白OD值×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×稀釋倍數(shù)FFA含量(U/L)=標(biāo)準(zhǔn)品OD值?空白OD值樣本OD值?空白OD值×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×稀釋倍數(shù)

性能指標(biāo)

指標(biāo) 分光光度法/微量法 ELISA法

線性范圍 0~50μmol/L 0.1-10U/L

最低檢測(cè)限 ≤0.1μmol/L ≤0.05U/L

回收率 90%~110% 90%~110%

批內(nèi)精密度 CV≤1.7% CV≤3.8%

批間精密度 CV≤5.0% CV≤8.5%

穩(wěn)定性 4℃保存6-12個(gè)月 2-8℃保存6-12個(gè)月

注意事項(xiàng)

樣本處理：

樣本需新鮮制備，避免FFA被氧化；-20℃可保存3個(gè)月

組織樣本需冰浴勻漿，避免酶失活

液體樣本需避免溶血和細(xì)菌污染

試劑使用：

試劑需臨用前配制，避免氧化失效

不同批號(hào)試劑不能混用，需重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)品需4℃保存，避免反復(fù)凍融

測(cè)定過程：

反應(yīng)溫度需嚴(yán)格控制在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）

加入樣品啟動(dòng)反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻比色測(cè)定

若吸光度值超出線性范圍，需稀釋樣本后重新測(cè)定

質(zhì)量控制：

每次實(shí)驗(yàn)需設(shè)置空白對(duì)照和質(zhì)控樣本

定期校準(zhǔn)儀器，確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性

若結(jié)果偏差較大，需檢查試劑是否變質(zhì)或樣本處理是否正確

公司正在出售的產(chǎn)品