游離膽固醇（FC）含量測試盒

測定意義與原理

測定意義

游離膽固醇（FC）是構(gòu)成細(xì)胞膜的主要成分之一，同時(shí)也是合成多種生理活性物質(zhì)（如腎上腺皮質(zhì)激素、性激素、膽汁酸和維生素D等）的重要前體。組織或細(xì)胞中FC的濃度變化是脂代謝狀態(tài)的一項(xiàng)重要指標(biāo)，其含量檢測具有重要意義：臨床診斷：診斷和監(jiān)測心腦血管疾病、肝臟疾病、腎臟疾病等疾病監(jiān)測：評(píng)估脂代謝狀態(tài)、組織損傷程度和治療效果生物學(xué)研究：了解脂代謝途徑、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖機(jī)制藥物研發(fā)：篩選降脂藥物，用于治療高血脂、脂肪肝等食品工業(yè)：評(píng)估食品品質(zhì)、新鮮度和貯藏條件農(nóng)業(yè)應(yīng)用：研究植物抗逆性機(jī)制、果實(shí)成熟過程等

測定原理

比色法/COD-PAP法/分光光度法：血液中的膽固醇約1/3為游離膽固醇，2/3為與脂肪酸結(jié)合的膽固醇酯，后者被膽固醇酯酶（CEH）水解為游離膽固醇；游離膽固醇被膽固醇氧化酶（COD）氧化成膽甾烯酮，并產(chǎn)生過氧化氫；再經(jīng)過氧化物酶（POD）催化，使4-氨基安替比林與酚（三者合稱PAP）反應(yīng)，生成紅色醌亞胺色素（Trinder反應(yīng)），當(dāng)CEH不存在時(shí)，膽固醇酯不能被水解，因而只能檢測到游離膽固醇的含量，分光光度計(jì)在500~520nm處進(jìn)行比色測定，用于定量測定人或動(dòng)物的血清、血漿、腦脊液。

ELISA法：采用雙抗體夾心法，將游離膽固醇與特異性抗體結(jié)合，通過酶標(biāo)二抗檢測結(jié)合的游離膽固醇，根據(jù)吸光度值計(jì)算游離膽固醇含量。

試劑盒組成

比色法/COD-PAP法/分光光度法試劑盒

組分 規(guī)格 作用說明

提取液 液體60mL×1瓶 用于提取樣本中的FC

試劑一 液體45mL×1瓶 含反應(yīng)緩沖液，用于提供適宜的反應(yīng)pH環(huán)境

試劑二 粉劑×1瓶 含膽固醇氧化酶（COD），反應(yīng)底物

試劑三 粉劑×1瓶 含過氧化物酶（POD）、4-氨基安替比林與酚（PAP），顯色劑

標(biāo)準(zhǔn)品 1mL×1支 含F(xiàn)C標(biāo)準(zhǔn)液，用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

ELISA法試劑盒

組分 規(guī)格 作用說明

包被板 96孔×1塊 預(yù)包被抗FC單克隆抗體

酶標(biāo)抗體 液體6mL×1瓶 含HRP標(biāo)記抗FC抗體

標(biāo)準(zhǔn)品 液體1mL×6管 含0.1-10ng/mL FC標(biāo)準(zhǔn)品

樣本稀釋液 10mL×1瓶 用于稀釋樣本和標(biāo)準(zhǔn)品

顯色劑A液 6mL×1瓶 含過氧化氫溶液

顯色劑B液 6mL×1瓶 含TMB溶液

終止液 6mL×1瓶 含硫酸溶液

20倍濃縮洗滌液 20mL×1瓶 用于洗滌酶標(biāo)板

自備儀器與試劑

必備儀器

比色法/COD-PAP法/分光光度法：分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、恒溫水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL石英比色皿/96孔板、研缽、電子天平

ELISA法：酶標(biāo)儀（450nm檢測通道）、96孔板、37℃恒溫箱、洗板機(jī)、可調(diào)式移液器、臺(tái)式離心機(jī)

必備耗材

離心管（1.5mL/10mL）、一次性吸頭、研缽/組織勻漿器、超聲破碎儀

自備試劑：蒸餾水/去離子水、生理鹽水

樣本前處理方法

動(dòng)物組織樣本取樣：稱取約0.1g組織，加入1mL無水乙醇勻漿：在冰上勻漿離心：以8,000g離心10分鐘，4℃，使用上清液進(jìn)行測定，并放置在冰上進(jìn)行測試

細(xì)胞或細(xì)菌樣本收集：收集5×10^6個(gè)細(xì)胞或細(xì)菌到離心管中，在離心后棄去上清液破碎：加入1mL無水乙醇，在冰浴中超聲破碎細(xì)胞或細(xì)菌5分鐘（功率20%或200W，超聲3秒，間隔7秒，重復(fù)30次）離心：以8,000g離心10分鐘，4℃，使用上清液進(jìn)行測定，并放置在冰上進(jìn)行測試

血清(漿)樣品

血清(漿)樣品：直接檢測

植物組織樣本取樣：按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿離心：8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測

測定操作步驟

比色法/COD-PAP法/分光光度法操作儀器預(yù)熱：分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到500~520nm，蒸餾水調(diào)零試劑配制：

試劑二：臨用前加入10mL蒸餾水充分溶解備用

試劑三：臨用前加入20mL蒸餾水充分溶解備用樣本測定：

試劑名稱(μL) 空白管 測定管

蒸餾水/樣本 100 100

試劑一 700 700

試劑二 100 100

試劑三 100 100

混勻后37℃水浴15min，記錄500~520nm處的吸光值A(chǔ)空白和A測定標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：將FC標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成0、0.031、0.063、0.125、0.25、0.5、1μmol/L系列濃度，同樣處理，測定500~520nm處的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

ELISA法操作試劑準(zhǔn)備：將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，室溫平衡15-30分鐘；將20×洗滌緩沖液用蒸餾水20倍稀釋后備用加樣：

從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃

設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加溫育：除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入HRP標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min洗滌：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）顯色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min終止：每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值結(jié)果計(jì)算：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按曲線方程計(jì)算樣本濃度

結(jié)果計(jì)算方法

單位定義

mmol/L：每升樣本中FC的含量

mmol/g 鮮重：每克組織中FC的含量

ng/mL：每毫升樣本中FC的含量

比色法/COD-PAP法/分光光度法計(jì)算公式

FC含量(mmol/L)=樣本OD值?空白OD值標(biāo)準(zhǔn)品OD值?空白OD值×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×稀釋倍數(shù)FC含量(mmol/L)=標(biāo)準(zhǔn)品OD值?空白OD值樣本OD值?空白OD值×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×稀釋倍數(shù) FC含量(mmol/g 鮮重)=樣本OD值?空白OD值標(biāo)準(zhǔn)品OD值?空白OD值×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×稀釋倍數(shù)×V總m×1000FC含量(mmol/g 鮮重)=標(biāo)準(zhǔn)品OD值?空白OD值樣本OD值?空白OD值×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×稀釋倍數(shù)×m×1000V總

V總：樣本勻漿液總體積（mL）

m：組織樣本取樣量（g）

ELISA法計(jì)算公式

FC含量(ng/mL)=樣本OD值?空白OD值標(biāo)準(zhǔn)品OD值?空白OD值×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×稀釋倍數(shù)FC含量(ng/mL)=標(biāo)準(zhǔn)品OD值?空白OD值樣本OD值?空白OD值×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×稀釋倍數(shù)

性能指標(biāo)

指標(biāo) 比色法/COD-PAP法/分光光度法 ELISA法

線性范圍 0~13mmol/L 0.1-10ng/mL

最低檢測限 ≤0.031mmol/L ≤0.05ng/mL

回收率 90%~110% 90%~110%

批內(nèi)精密度 CV≤2.2% CV≤3.8%

批間精密度 CV≤5.0% CV≤8.5%

穩(wěn)定性 2-8℃保存6-12個(gè)月 2-8℃保存6-12個(gè)月

注意事項(xiàng)

樣本處理：

樣本需新鮮制備，避免FC被氧化；-20℃可保存3個(gè)月，-80℃可保存1年

組織樣本需冰浴勻漿，避免酶失活

液體樣本需避免溶血和細(xì)菌污染

檢測FC的血清或血漿宜用EDTA或肝素抗凝，如不能及時(shí)測定，密閉保存，4℃可穩(wěn)定1周，-20℃可以穩(wěn)定半年以上

試劑使用：

試劑需臨用前配制，避免氧化失效

不同批號(hào)試劑不能混用，需重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)品需4℃保存，避免反復(fù)凍融

測定過程：

反應(yīng)溫度需嚴(yán)格控制在37℃

加入樣品啟動(dòng)反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻比色測定

若吸光度值超出線性范圍，需稀釋樣本后重新測定，結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)

質(zhì)量控制：

每次實(shí)驗(yàn)需設(shè)置空白對(duì)照和質(zhì)控樣本

定期校準(zhǔn)儀器，確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確性

若結(jié)果偏差較大，需檢查試劑是否變質(zhì)或樣本處理是否正確

其他注意事項(xiàng)：

該試劑盒既可作終點(diǎn)法檢測，又可作速率法檢測

本法不適于檢測總膽固醇的濃度，如需檢測總膽固醇(TC)含量，請(qǐng)選擇相關(guān)產(chǎn)品

公司正在出售的產(chǎn)品