商品屬性
產(chǎn)品名稱 | 總巰基測試盒 | 產(chǎn)品貨號 | BH-961175 |
規(guī)格 | 100管/48樣、50管/24樣 | 產(chǎn)品分類 | 氧化與抗氧化系列 |
測試方法 | 微量法、可見分光光度法 | 用途 | 僅供科研實驗 |
測定意義與原理
測定意義
總巰基（-SH）是生物體內(nèi)重要的功能性基團，具有多種生理和病理意義：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能：參與蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定，影響酶活性和信號傳導(dǎo)抗氧化作用：谷胱甘肽等巰基化合物是重要的內(nèi)源性抗氧化劑，清除自由基氧化應(yīng)激評估：總巰基含量下降是氧化損傷的敏感指標疾病診斷：與心血管疾病、癌癥、神經(jīng)退行性疾病等密切相關(guān)食品品質(zhì)控制：面粉、肉類、乳制品等的新鮮度和加工質(zhì)量指標
測定原理
采用Ellman法（DTNB顯色法），反應(yīng)原理如下： R-SH+DTNB→R-S-S-TNB+TNB?R-SH+DTNB→R-S-S-TNB+TNB? 巰基基團與5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（DTNB）反應(yīng)，生成黃色的2-硝基-5-硫代苯甲酸（TNB?），在412nm處有最大吸收峰，吸光度與總巰基含量成正比。
試劑盒組成
組分 規(guī)格 作用說明
試劑A 液體100mL×1瓶 含0.1mol/L磷酸緩沖液，pH8.0，提供反應(yīng)環(huán)境
試劑B 液體20mL×1瓶 含10mmol/L DTNB溶液，顯色劑，與巰基反應(yīng)產(chǎn)生黃色化合物
試劑C 粉劑×1支 含2mmol/L谷胱甘肽（GSH）標準品，用于建立標準曲線
提取液 液體100mL×1瓶 含5%三氯乙酸（TCA），用于蛋白質(zhì)沉淀和巰基提取
自備儀器與試劑
必備儀器
分光光度法：可見分光光度計（412nm檢測通道）、1mL玻璃比色皿
微量法：酶標儀（412nm檢測通道）、96孔板
通用：低溫離心機（≥11000g）、恒溫水浴鍋、可調(diào)式移液器、漩渦混勻器
必備耗材
離心管（1.5mL/10mL）、一次性吸頭、研缽/組織勻漿器
自備試劑：蒸餾水/去離子水、生理鹽水、抗凝劑（肝素/檸檬酸鈉）
樣本前處理方法
動植物組織樣本取新鮮組織約0.1g，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分加入1mL提取液，冰浴勻漿，室溫靜置10min11000g 4℃離心10min，取上清液用試劑A稀釋1-10倍后測定
細胞樣本收集500萬對數(shù)生長期細胞，8000g 4℃離心5min棄上清加入1mL提取液，冰浴超聲波破碎（功率200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）11000g 4℃離心10min，取上清液用試劑A稀釋1-10倍后測定
血清/血漿樣本血清樣本：血液凝固后3000g 4℃離心10min，取上清直接測定或-80℃保存血漿樣本：用肝素/檸檬酸鈉抗凝，5000g 4℃離心10min，取上清直接測定樣本避免溶血，溶血會導(dǎo)致結(jié)果偏高
食品樣本面粉：取約0.1g面粉，加入1mL提取液，振蕩混勻，室溫靜置30min肉類/乳制品：取約0.5g樣本，加入2mL提取液，冰浴勻漿11000g 4℃離心10min，取上清液用試劑A稀釋1-10倍后測定
測定操作步驟
標準曲線建立將2mmol/L谷胱甘肽標準品用試劑A稀釋成0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0mmol/L系列濃度取比色管/96孔板，加入標準品溶液0.2mL + 試劑B 0.05mL，混勻37℃水浴反應(yīng)10min，412nm波長下測定吸光度以巰基濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線
樣本測定工作液配制：取試劑B 1mL + 試劑A 4mL，混勻即為工作液（現(xiàn)配現(xiàn)用）樣本處理：取樣本0.2mL + 工作液0.05mL，混勻反應(yīng)與測定：37℃水浴反應(yīng)10min，412nm波長下測定吸光度空白對照：取試劑A 0.2mL + 工作液0.05mL，同樣處理
結(jié)果計算方法
單位定義
μmol/g 鮮重：每克組織鮮重中總巰基的含量
μmol/L：每毫升血清/血漿中總巰基的含量
μmol/mgprot：每毫克蛋白中總巰基的含量
計算公式
總巰基含量(μmol/g鮮重)=(A樣?A空)×C標×V總(A標?A空標)×W總巰基含量(μmol/g鮮重)=(A標?A空標)×W(A樣?A空)×C標×V總
A樣-A空：樣本扣除空白后的吸光度值
C標：標準品濃度（μmol/L）
V總：樣本提取液總體積（mL）
A標-A空標：標準品扣除空白后的吸光度值
W：樣本質(zhì)量（g）
簡化公式
按體積計算：總巰基（μmol/L）= C標 × (A樣-A空)/(A標-A空標)
按鮮重計算：總巰基（μmol/g鮮重）= C標 × (A樣-A空)/(A標-A空標) × V總/W
性能指標
指標 要求
線性范圍 0~2μmol/L谷胱甘肽當量，線性相關(guān)系數(shù)r≥0.995
最低檢測限 ≤0.05μmol/L
回收率 90%~110%
批內(nèi)精密度 CV≤5.0%
批間精密度 CV≤8.0%
穩(wěn)定性 2-8℃保存12個月，活性保留≥90%
注意事項
樣本處理：
樣本需新鮮制備，避免巰基氧化；-80℃可保存1個月
提取液含三氯乙酸，需在通風(fēng)櫥中操作，避免接觸皮膚和眼睛
樣本中不能添加巰基乙醇、DTT等還原劑，以免干擾測定
試劑使用：
DTNB溶液對光敏感，需避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用
標準品需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免氧化失效
不同批號試劑不能混用，需重新繪制標準曲線
測定過程：
反應(yīng)溫度需嚴格控制在37℃，反應(yīng)時間10min
若吸光度值超出線性范圍，需稀釋樣本后重新測定
每個樣本需設(shè)置至少3個平行實驗，結(jié)果取平均值
質(zhì)量控制：
每次實驗需設(shè)置空白對照和質(zhì)控樣本
定期校準儀器，確保檢測結(jié)果準確性
若結(jié)果偏差較大，需檢查試劑是否變質(zhì)或樣本處理是否正確
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