商品屬性
產(chǎn)品名稱 | 非蛋白質(zhì)巰基測試盒 | 產(chǎn)品貨號 | BH-961180 |
規(guī)格 | 100管/48樣、50管/24樣 | 產(chǎn)品分類 | 氧化與抗氧化系列 |
測試方法 | 微量法、可見分光光度法 | 用途 | 僅供科研實驗 |
測定意義與原理
測定意義
非蛋白質(zhì)巰基（NP-SH）是生物體內(nèi)重要的小分子抗氧化劑，具有多種生理功能：抗氧化作用：清除自由基，保護細胞免受氧化損傷金屬解毒：與重金屬結合，促進其排出體外細胞信號傳導：參與細胞內(nèi)氧化還原信號調(diào)節(jié)疾病診斷：與心血管疾病、糖尿病、腫瘤等密切相關環(huán)境毒理：作為重金屬污染和氧化應激的生物標志物
測定原理
采用Ellman法，利用三氯乙酸（TCA）沉淀蛋白質(zhì)，游離的非蛋白質(zhì)巰基留在上清液中，與Ellman試劑（DTNB）反應生成黃色的2-硝基-5-硫代苯甲酸（TNB?），在412nm處有最大吸收峰，吸光度與非蛋白質(zhì)巰基含量成正比。反應式如下： NP-SH+DTNB→NP-S-S-TNB+TNB?(黃色)NP-SH+DTNB→NP-S-S-TNB+TNB?(黃色)
試劑盒組成
組分 規(guī)格 作用說明
試劑A 液體100mL×1瓶 含0.1mol/L磷酸緩沖液，pH8.0，提供反應環(huán)境
試劑B 液體20mL×1瓶 含10mmol/L DTNB溶液，顯色劑，與巰基反應產(chǎn)生黃色化合物
試劑C 液體100mL×1瓶 含10%三氯乙酸（TCA），用于蛋白質(zhì)沉淀
標準品 液體1mL×1支 含10mmol/L谷胱甘肽（GSH）標準品，用于建立標準曲線
提取液 液體100mL×1瓶 含0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.4，用于動植物組織和細胞樣本提取
自備儀器與試劑
必備儀器
分光光度法：可見分光光度計（412nm檢測通道）、1mL玻璃比色皿
微量法：酶標儀（412nm檢測通道）、96孔板
通用：低溫離心機（≥12000g）、恒溫水浴鍋、可調(diào)式移液器、漩渦混勻器
必備耗材
離心管（1.5mL/10mL）、一次性吸頭、研缽/組織勻漿器
自備試劑：蒸餾水/去離子水、生理鹽水、抗凝劑（肝素/檸檬酸鈉）
樣本前處理方法
動植物組織樣本取新鮮組織約0.1g，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分加入1mL提取液，冰浴勻漿，室溫靜置10min10000g 4℃離心10min，取上清液1mL加入1mL試劑C，混勻室溫靜置10min，12000g 4℃離心10min，取上清液用試劑A稀釋1-10倍后測定
細胞樣本收集500萬對數(shù)生長期細胞，8000g 4℃離心5min棄上清加入1mL提取液，冰浴超聲波破碎（功率200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）10000g 4℃離心10min，取上清液1mL加入1mL試劑C，混勻室溫靜置10min，12000g 4℃離心10min，取上清液用試劑A稀釋1-10倍后測定
血清/血漿樣本血清樣本：血液凝固后3000g 4℃離心10min，取上清直接測定或-80℃保存血漿樣本：用肝素/檸檬酸鈉抗凝，5000g 4℃離心10min，取上清直接測定樣本避免溶血，溶血會導致結果偏高
尿液樣本取新鮮尿液，3000g 4℃離心10min，取上清液直接測定若非蛋白質(zhì)巰基含量過高，可用試劑A稀釋1-10倍后測定樣本可-80℃保存1個月，解凍后離心取上清
測定操作步驟
標準曲線建立將10mmol/L谷胱甘肽標準品用試劑A稀釋成0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0mmol/L系列濃度取比色管/96孔板，加入標準品溶液0.2mL + 試劑B 0.05mL，混勻37℃水浴反應10min，412nm波長下測定吸光度以巰基濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線
樣本測定工作液配制：取試劑B 1mL + 試劑A 4mL，混勻即為工作液（現(xiàn)配現(xiàn)用）樣本處理：取樣本0.2mL + 工作液0.05mL，混勻反應與測定：37℃水浴反應10min，412nm波長下測定吸光度空白對照：取試劑A 0.2mL + 工作液0.05mL，同樣處理
結果計算方法
單位定義
μmol/g 鮮重：每克組織鮮重中非蛋白質(zhì)巰基的含量
μmol/L：每毫升血清/血漿中非蛋白質(zhì)巰基的含量
μmol/mgprot：每毫克蛋白中非蛋白質(zhì)巰基的含量
計算公式
非蛋白質(zhì)巰基含量(μmol/g鮮重)=(A樣?A空)×C標×V總(A標?A空標)×W非蛋白質(zhì)巰基含量(μmol/g鮮重)=(A標?A空標)×W(A樣?A空)×C標×V總
A樣-A空：樣本扣除空白后的吸光度值
C標：標準品濃度（μmol/L）
V總：樣本提取液總體積（mL）
A標-A空標：標準品扣除空白后的吸光度值
W：樣本質(zhì)量（g）
簡化公式
按體積計算：非蛋白質(zhì)巰基（μmol/L）= C標 × (A樣-A空)/(A標-A空標)
按鮮重計算：非蛋白質(zhì)巰基（μmol/g鮮重）= C標 × (A樣-A空)/(A標-A空標) × V總/W
性能指標
指標 要求
線性范圍 0~2μmol/L谷胱甘肽當量，線性相關系數(shù)r≥0.995
最低檢測限 ≤0.05μmol/L
回收率 90%~110%
批內(nèi)精密度 CV≤5.0%
批間精密度 CV≤8.0%
穩(wěn)定性 2-8℃保存12個月，活性保留≥90%
注意事項
樣本處理：
樣本需新鮮制備，避免巰基氧化；-80℃可保存1個月
提取液含三氯乙酸，需在通風櫥中操作，避免接觸皮膚和眼睛
樣本中不能添加巰基乙醇、DTT等還原劑，以免干擾測定
試劑使用：
DTNB溶液對光敏感，需避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用
標準品需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免氧化失效
不同批號試劑不能混用，需重新繪制標準曲線
測定過程：
反應溫度需嚴格控制在37℃，反應時間10min
若吸光度值超出線性范圍，需稀釋樣本后重新測定
每個樣本需設置至少3個平行實驗，結果取平均值
質(zhì)量控制：
每次實驗需設置空白對照和質(zhì)控樣本
定期校準儀器，確保檢測結果準確性
若結果偏差較大，需檢查試劑是否變質(zhì)或樣本處理是否正確
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關鍵字： 非蛋白質(zhì)巰基;測試盒;
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