商品屬性

測定意義與原理

測定意義

蛋白質羰基（Protein Carbonyl）是蛋白質氧化損傷的重要生物標志物：氧化應激標記：直接反映蛋白質被活性氧（ROS）氧化的程度疾病關聯(lián)：與衰老、神經退行性疾?。ò柎暮Ｄ　⑴两鹕。⑻悄虿?、心血管疾病、癌癥等密切相關環(huán)境脅迫響應：評估生物對輻射、重金屬、化學毒素等環(huán)境壓力的響應藥物研發(fā)：作為抗氧化藥物篩選和療效評價的重要指標

測定原理

采用2,4-二硝基苯肼（DNPH）比色法，DNPH與蛋白質羰基反應生成穩(wěn)定的2,4-二硝基苯腙，在370nm處有特征吸收峰，吸光度與蛋白質羰基含量成正比： 蛋白質-CO+DNPH→蛋白質-C=N-NH-C6H3(NO2)2+H2O蛋白質-CO+DNPH→蛋白質-C=N-NH-C6H3(NO2)2+H2O

試劑盒組成

組分 規(guī)格 作用說明

試劑A 液體25mL×1瓶 含10mmol/L DNPH的2mol/L鹽酸溶液，與羰基反應生成腙類化合物

試劑B 液體10mL×1瓶 含2mol/L鹽酸溶液，用于空白對照

試劑C 液體100mL×1瓶 含0.1mol/L磷酸緩沖液，pH7.4，用于樣本提取

試劑D 液體50mL×1瓶 含20%三氯乙酸（TCA）溶液，用于蛋白質沉淀

試劑E 液體25mL×1瓶 含乙醇-乙酸乙酯混合液（1:1，v/v），用于沉淀洗滌

試劑F 液體10mL×1瓶 含6mol/L鹽酸胍溶液，用于溶解蛋白質腙沉淀

標準品 液體1mL×1支 含10mmol/L蛋白質羰基標準品，用于建立標準曲線

自備儀器與試劑

必備儀器

分光光度法：可見分光光度計、臺式高速離心機、可調式移液器、1mL玻璃比色皿、漩渦混勻器

HPLC法：高效液相色譜儀、紫外檢測器、C18色譜柱

通用：-20℃冰箱、電子天平、恒溫水浴鍋

必備耗材

離心管（1.5mL/10mL）、一次性吸頭、研缽/組織勻漿器

自備試劑：蒸餾水/去離子水、生理鹽水、抗凝劑（肝素/EDTA）

樣本前處理方法

動植物組織樣本取新鮮組織，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分按質量(g):提取液(mL)=1:5~10比例（建議0.1g組織加1mL提取液）冰浴勻漿8000g 4℃離心15min，取上清置冰上待測測定樣本蛋白濃度，調整蛋白濃度在1-5mg/mL范圍內

細胞/細菌樣本收集對數(shù)生長期細胞/細菌，8000g 4℃離心5min棄上清按細胞數(shù)(10?):提取液(mL)=500~1000:1比例加入提取液，冰浴超聲破碎8000g 4℃離心15min，取上清置冰上待測測定樣本蛋白濃度，調整蛋白濃度在1-5mg/mL范圍內

液體樣本（血清/血漿/尿液/唾液等）血清樣本：血液凝固后3000g 4℃離心10min，取上清直接測定血漿樣本：加入肝素/EDTA抗凝后，3000g 4℃離心10min，取上清直接測定尿液/唾液：新鮮樣本3000g 4℃離心10min，取上清直接測定測定樣本蛋白濃度，調整蛋白濃度在1-5mg/mL范圍內

測定操作步驟

分光光度法操作

試劑準備：

試劑A：液體25mL×1瓶，2-8℃保存，避光

試劑B：液體10mL×1瓶，2-8℃保存

試劑C：液體100mL×1瓶，2-8℃保存

試劑D：液體50mL×1瓶，2-8℃保存

試劑E：液體25mL×1瓶，2-8℃保存

試劑F：液體10mL×1瓶，2-8℃保存

反應步驟：

測定管：取樣本0.5mL，加入試劑A 0.5mL，室溫避光反應1h

空白管：取樣本0.5mL，加入試劑B 0.5mL，室溫避光反應1h

蛋白質沉淀與洗滌：

兩管分別加入試劑D 1.0mL，漩渦混勻，4℃放置10min

8000g 4℃離心10min，棄上清，保留蛋白質沉淀

加入試劑E 2.0mL，漩渦混勻，洗滌沉淀，8000g 4℃離心10min，棄上清

重復洗滌步驟2-3次，以去除未反應的DNPH

溶解與測定：

兩管分別加入試劑F 1.0mL，漩渦混勻，37℃水浴10min，使沉淀完全溶解

8000g 4℃離心5min，取上清液，在370nm波長下測定吸光度（A樣、A空）

同時用試劑F調零

HPLC法操作

色譜條件：

色譜柱：C18柱（4.6×250mm，5μm）

流動相：甲醇-水（60:40，v/v），含0.1%三氟乙酸

流速：1.0mL/min

檢測波長：370nm

柱溫：30℃

進樣量：20μL

樣本前處理：

取樣本0.5mL，加入DNPH試劑0.5mL，室溫避光反應1h

蛋白質沉淀、洗滌后，用鹽酸胍溶解

0.22μm濾膜過濾，進樣分析

結果計算方法

單位定義

nmol/mgprot：每毫克蛋白質中蛋白質羰基的含量

nmol/mL：每毫升樣本中蛋白質羰基的含量

分光光度法計算公式

蛋白質羰基含量(nmol/mgprot)=(A樣?A空)×V總ε×Cpr×V樣蛋白質羰基含量(nmol/mgprot)=ε×Cpr×V樣(A樣?A空)×V總

A樣-A空：樣本扣除空白后的吸光度值

V總：最終溶解液體積（1.0mL）

ε：摩爾消光系數(shù)（22,000 L/(mol·cm)）

Cpr：樣本蛋白濃度（mg/mL）

V樣：樣本初始體積（0.5mL）

簡化公式

按蛋白含量計算：蛋白質羰基（nmol/mgprot）= 4.5×(A樣-A空)÷Cpr

按液體體積計算：蛋白質羰基（nmol/mL）= 4.5×(A樣-A空)

HPLC法計算以外標法或內標法定量，根據(jù)標準品峰面積計算蛋白質羰基含量結果以nmol/mgprot或nmol/mL表示

性能指標

指標 要求

線性范圍 0~10nmol/mgprot，線性相關系數(shù)r≥0.995

最低檢測限 ≤0.1nmol/mgprot

回收率 90%~110%

批內精密度 CV≤5.0%

批間精密度 CV≤8.0%

穩(wěn)定性 2-8℃保存12個月，活性保留≥90%

注意事項

樣本處理：

樣本需新鮮制備，避免蛋白質進一步氧化；-80℃可保存1個月

樣本處理過程中需避免接觸金屬離子、強光和高溫

樣本蛋白濃度需調整在1-5mg/mL范圍內，確保反應完全

試劑使用：

DNPH試劑對光敏感，配制后需避光保存

鹽酸胍溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免分解

不同批號試劑不能混用，需重新繪制標準曲線

測定過程：

反應需在室溫避光條件下進行，避免陽光直射

沉淀洗滌需徹底，以去除未反應的DNPH，否則會導致結果偏高

溶解沉淀時需確保完全溶解，否則會導致結果偏低

質量控制：

每次實驗需設置空白對照和質控樣本

定期校準儀器，確保檢測結果準確性

若結果偏差較大，需檢查試劑是否變質或樣本處理是否正確

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