預期用途

本試劑盒用于定性檢測人結膜拭子、咽拭子、糞便或其它臨床樣本中的柯薩奇病毒A24型變種（CVA24v）RNA。適用于：

急性出血性結膜炎（AHC）病原體篩查

疫情暴發(fā)時的快速病原鑒定

流行病學調查

注：結果需結合臨床表現及其他診斷指標綜合判斷，不可作為唯一診斷依據。

檢測原理

RNA提?。簶颖局胁《綬NA通過裂解液釋放并純化。

逆轉錄（RT）：提取的RNA逆轉錄為cDNA。

熒光定量PCR（qPCR）：

采用特異性引物靶向CVA24v保守區(qū)域（如VP1基因）。

DNA染料法（如SYBR Green/Evagreen）：與雙鏈DNA結合后發(fā)射熒光信號，實時監(jiān)測擴增進程。

通過Ct值（循環(huán)閾值）判定病毒載量。

主要組成成分

| 組分 | 規(guī)格（96測試） | 保存條件 |

| CVA24v RT-PCR預混液 | 1.2 mL × 1管 | -20℃ |

| 逆轉錄酶 | 40 μL × 1管 | -20℃ |

| RNase-Free水 | 1 mL × 1管 | 室溫 |

| CVA24v陽性對照 | 200 μL × 1管（假病毒）| -70℃ |

| 陰性對照 | 1 mL × 1管（生理鹽水）| 4℃ |

儲存及有效期

儲存條件：-20℃避光保存（避免反復凍融）

有效期：12個月

樣本要求

| 樣本類型 | 采集/處理要求 |

| 結膜/咽拭子 | 置于病毒保存液中，2-8℃保存≤72小時；長期儲存需-70℃凍存。 |

| 糞便 | 取1-2g懸浮于PBS中，離心取上清液。 |

| 運輸條件 | 冰袋（2-8℃）或干冰（-70℃）運輸，符合UN3373生物安全要求。 |

檢測流程

1. RNA提取

推薦使用商業(yè)化RNA提取試劑盒（如QIAamp Viral RNA Kit）。

2. RT-PCR反應體系配制（以20μL體系為例）

| 組分 | 體積 |

| RT-PCR預混液 | 10 μL |

| 逆轉錄酶 | 0.5 μL |

| RNA模板 | 5 μL |

| RNase-Free水 | 補足至20 μL|

3. 擴增程序（需在熒光定量PCR儀上運行）

| 步驟 | 溫度 | 時間 | 循環(huán)數 | 信號采集 |

| 逆轉錄 | 50℃ | 15 min | 1 | 否 |

| 預變性 | 95℃ | 3 min | 1 | 否 |

| PCR擴增 | 95℃ | 10 sec | 40 | 是 |

| | 60℃ | 30 sec | | 是 |

| 熔解曲線分析 | 65℃→95℃ | 0.5℃/sec | 1 | 是 |

結果判讀

陽性：

Ct值 ≤ 38.0，且熔解曲線峰值溫度與陽性對照一致（如82.5±1℃）。

陰性：

Ct值 = 40 或無擴增曲線。

無效：

陽性對照Ct值＞38 或陰性對照出現擴增 → 實驗需重做。

性能參數

靈敏度：檢出限（LOD）≤ 50 copies/mL

特異性：

不與其他常見腸道病毒（如EV70、CA16、EV71）交叉反應；

與腺病毒、流感病毒無交叉。

符合率：與Sanger測序相比，陽性/陰性符合率均 ≥ 98%。

注意事項

本試劑盒僅限專業(yè)人員在生物安全二級（BSL-2）實驗室使用。

所有樣本需視為潛在傳染性物質，操作時穿戴防護裝備。

避免試劑反復凍融（建議分裝保存）。

熔解曲線分析是鑒別非特異性擴增的關鍵步驟。

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