?產品名稱:馬傳染性貧血病毒PCR檢測試劑盒
英文名稱:Equine Infectious Anemia Virus(EIAV)RTPCR
貨號:YS-P014166
分類:PCR檢測試劑盒
規(guī)格?:50T/盒
檢測原理:
靶標馬傳貧病毒反轉錄酶基因,僅識別慢病毒屬馬傳染性貧血毒株
馬匹外周血單核細胞提取病毒 RNA,反轉錄合成 cDNA 后熒光 PCR 擴增
設置陰性馬血對照,排除馬自身基因組核酸造成的非特異性擴增
實驗流程:
(一)反應體系配制(冰上操作,防酶失活與污染)
按 “水→緩沖液→dNTP→引物→模板→Taq 酶” 順序加樣(酶最后加,避免失活)。
輕輕渦旋混勻,短暫離心(3000rpm,10s),使液體沉至管底。
無熱蓋的 PCR 儀:加 1 滴礦物油覆蓋液面,防止蒸發(fā)。
(二)PCR 程序設置(標準 35 循環(huán))
預變性:94℃,3-5min(徹底變性模板 DNA)。
循環(huán)階段(35 次):
變性:94℃,30s(雙鏈解鏈)。
退火:55-65℃,30s(引物結合模板,按引物 Tm 值調整)。
延伸:72℃,1min/kb(Taq 酶合成新鏈,1kb 片段約 1min)。
終延伸:72℃,5-10min(確保片段完整延伸)。
保溫:4℃,∞(防止非特異性復性,短期保存)。
(三)產物檢測(瓊脂糖凝膠電泳)
制膠:1% 瓊脂糖凝膠(1g 瓊脂糖 + 100mL 1×TAE 緩沖液),加熱融化后加核酸染料,倒膠插梳,凝固 30min。
上樣:取 5μL PCR 產物 + 1μL 上樣緩沖液,點樣;同時加 DNA Marker(分子量對照)。
電泳:120V,20-30min,至溴酚藍遷移至凝膠 2/3 處。
成像:凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶,目標片段位置與預期一致則為陽性。
四、參數優(yōu)化
退火溫度(Tm):引物 Tm 值 = 4×(G+C)+2×(A+T),退火溫度一般低于 Tm 值 5℃,溫度過高無條帶,過低非特異性條帶多。
Mg2?濃度:1.5-2.5mM,濃度過低酶活性低、產量少;過高非特異性擴增增加。
循環(huán)數:25-35 個循環(huán),少于 25 個產物不足,多于 35 個易出現非特異性條帶。
延伸時間:按目標片段長度調整,≤1kb 用 1min,1-3kb 用 2-3min。
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注意事項:
分區(qū)操作:試劑配制、樣品處理、PCR擴增需在獨立區(qū)域進行,避免交叉污染
無菌操作:使用帶濾芯槍頭、一次性手套和專用工作服
試劑準備:所有試劑使用前需完全融化,震蕩混勻后短暫離心
避光保存:含熒光探針的試劑需避光保存和操作
防止污染:陽性對照操作需最后進行,實驗后用10%次氯酸或75%酒精消毒工作臺
關鍵字: 馬傳染性貧血病毒;PCR檢測試劑盒;
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