基本信息?

?中文名稱?：miRNA加尾染料法熒光定量PCR試劑盒

貨號：P-PR1432

規(guī)格：200反應、300反應、400反應

?英文名稱?：miRNA Poly(A) Tailing Dye-based Quantitative PCR Kit
作用機制：先通過加尾酶為miRNA添加多聚腺苷酸尾，再利用反轉錄酶將加尾后的miRNA反轉錄成cDNA，隨后以cDNA為模板，使用通用引物和特異性引物進行PCR擴增，同時借助染料（如SYBR Green）與雙鏈DNA結合產生熒光信號，實現(xiàn)對miRNA的定量檢測。 

適用樣本：總RNA樣本（需包含miRNA），如細胞總RNA、組織總RNA、血清血漿總RNA等。
產品簡介

本試劑盒采用SYBR Green I嵌合染料法原理，結合加尾法技術實現(xiàn)miRNA的熒光定量檢測。核心組分是經過優(yōu)化的Hotmaster Taq DNA聚合酶與Buffer體系，可有效抑制非特異性擴增，對寬廣濃度范圍的模板進行準確定量，具備靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好等特點。預混液中含有通用型ROX，適用于所有qPCR儀，無需額外添加ROX校正儀器。 需注意，本試劑盒需與增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒（加尾法）配套使用。

產品組成

組分 規(guī)格（125rxn） 規(guī)格（500rxn）

2×Universal miRNA SYBR Green qPCR Mix 1.25ml 1.25ml×4

Reverse primer（10μM） 55μl 55μl×4

RNase-Free H?O 1ml /

自備試劑

待檢測miRNA對應的qPCR上游引物（Forward primer），需自行設計合成，設計原則如下：

遵循引物設計通用原則

以成熟miRNA序列為基礎，將U替換為T

上游引物Tm值盡量與試劑盒下游引物（Tm=65℃）保持一致

若Tm值過低，可在5’端添加G/C堿基，或在3’端添加A堿基，或同時修飾兩端

若Tm值過高，可在5’或3’端去掉部分堿基

操作步驟

一、實驗前準備

將DNA模板、引物、2×Universal miRNA SYBR Green qPCR Mix、RNase-Free H?O溶解后置冰上備用

使用前將2×miRNA qPCR Mix上下顛倒輕輕混勻，避免起泡，輕微離心后使用

二、qPCR反應體系配制（20μl體系）

組分 體積 終濃度

2×Universal SYBR Green qPCR Mix 10μl 1×

miRNA第一鏈cDNA 1-2μl /

Forward Primer（10μM） 0.4μl 0.2μM

Reverse Primer（10μM） 0.4μl 0.2μM

RNase-Free H?O 補足至20μl /

注意事項：

miRNA第一鏈cDNA用量不應超過總反應體系的10%，高豐度miRNA需適當稀釋cDNA模板（10倍或100倍）

操作過程中避免強光照射，防止熒光染料分解

引物濃度可在0.1-1.0μM范圍內優(yōu)化，擴增效率低時提高引物濃度，非特異性反應時降低引物濃度

三、qPCR反應程序設置

可選擇二步法或三步法擴增：

二步法（特異性高）

預變性：95℃ 30s

擴增循環(huán)（40次）：95℃ 5s，60-65℃ 30s（采集熒光信號）

溶解曲線分析：95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s

三步法（擴增效率高）

預變性：95℃ 30s

擴增循環(huán)（40次）：95℃ 5s，55-60℃ 30s，72℃ 30s（采集熒光信號）

溶解曲線分析：95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s

注意事項：

退火溫度需根據(jù)引物Tm值調整

延伸時間需根據(jù)qPCR儀數(shù)據(jù)采集時間調整

溶解曲線分析需按照儀器推薦程序設置

保存條件

試劑盒整體置于-20℃保存，有效期24個月

避免反復凍融，qPCR Mix短期使用可存放于4℃

Reverse primer每次使用后需立即放回-20℃保存

注意事項

實驗操作需在無RNase環(huán)境中進行，使用無菌無酶耗材

配制反應體系時需在冰上操作，避免試劑降解

若出現(xiàn)非特異性擴增，可適當提高退火溫度或優(yōu)化引物濃度

實驗結果需結合溶解曲線分析判斷擴增特異性

定量檢測需設置標準曲線，標準品梯度建議覆蓋5個數(shù)量級

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