基本信息?
?中文名稱?：miRNA加尾染料法熒光定量PCR試劑盒
貨號(hào)：P-PR1432
規(guī)格：200反應(yīng)、300反應(yīng)、400反應(yīng)
?英文名稱?：miRNA Poly(A) Tailing Dye-based Quantitative PCR Kit
作用機(jī)制：先通過加尾酶為miRNA添加多聚腺苷酸尾，再利用反轉(zhuǎn)錄酶將加尾后的miRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后以cDNA為模板，使用通用引物和特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)借助染料（如SYBR Green）與雙鏈DNA結(jié)合產(chǎn)生熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA的定量檢測。
適用樣本：總RNA樣本（需包含miRNA），如細(xì)胞總RNA、組織總RNA、血清血漿總RNA等。
產(chǎn)品簡介
本試劑盒采用SYBR Green I嵌合染料法原理，結(jié)合加尾法技術(shù)實(shí)現(xiàn)miRNA的熒光定量檢測。核心組分是經(jīng)過優(yōu)化的Hotmaster Taq DNA聚合酶與Buffer體系，可有效抑制非特異性擴(kuò)增，對(duì)寬廣濃度范圍的模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量，具備靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。預(yù)混液中含有通用型ROX，適用于所有qPCR儀，無需額外添加ROX校正儀器。 需注意，本試劑盒需與增強(qiáng)型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒（加尾法）配套使用。
產(chǎn)品組成
組分 規(guī)格（125rxn） 規(guī)格（500rxn）
2×Universal miRNA SYBR Green qPCR Mix 1.25ml 1.25ml×4
Reverse primer（10μM） 55μl 55μl×4
RNase-Free H?O 1ml /
自備試劑
待檢測miRNA對(duì)應(yīng)的qPCR上游引物（Forward primer），需自行設(shè)計(jì)合成，設(shè)計(jì)原則如下：
遵循引物設(shè)計(jì)通用原則
以成熟miRNA序列為基礎(chǔ)，將U替換為T
上游引物Tm值盡量與試劑盒下游引物（Tm=65℃）保持一致
若Tm值過低，可在5’端添加G/C堿基，或在3’端添加A堿基，或同時(shí)修飾兩端
若Tm值過高，可在5’或3’端去掉部分堿基
操作步驟
一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
將DNA模板、引物、2×Universal miRNA SYBR Green qPCR Mix、RNase-Free H?O溶解后置冰上備用
使用前將2×miRNA qPCR Mix上下顛倒輕輕混勻，避免起泡，輕微離心后使用
二、qPCR反應(yīng)體系配制（20μl體系）
組分 體積 終濃度
2×Universal SYBR Green qPCR Mix 10μl 1×
miRNA第一鏈cDNA 1-2μl /
Forward Primer（10μM） 0.4μl 0.2μM
Reverse Primer（10μM） 0.4μl 0.2μM
RNase-Free H?O 補(bǔ)足至20μl /
注意事項(xiàng)：
miRNA第一鏈cDNA用量不應(yīng)超過總反應(yīng)體系的10%，高豐度miRNA需適當(dāng)稀釋cDNA模板（10倍或100倍）
操作過程中避免強(qiáng)光照射，防止熒光染料分解
引物濃度可在0.1-1.0μM范圍內(nèi)優(yōu)化，擴(kuò)增效率低時(shí)提高引物濃度，非特異性反應(yīng)時(shí)降低引物濃度
三、qPCR反應(yīng)程序設(shè)置
可選擇二步法或三步法擴(kuò)增：
二步法（特異性高）
預(yù)變性：95℃ 30s
擴(kuò)增循環(huán)（40次）：95℃ 5s，60-65℃ 30s（采集熒光信號(hào)）
溶解曲線分析：95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s
三步法（擴(kuò)增效率高）
預(yù)變性：95℃ 30s
擴(kuò)增循環(huán)（40次）：95℃ 5s，55-60℃ 30s，72℃ 30s（采集熒光信號(hào)）
溶解曲線分析：95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s
注意事項(xiàng)：
退火溫度需根據(jù)引物Tm值調(diào)整
延伸時(shí)間需根據(jù)qPCR儀數(shù)據(jù)采集時(shí)間調(diào)整
溶解曲線分析需按照儀器推薦程序設(shè)置
保存條件
試劑盒整體置于-20℃保存，有效期24個(gè)月
避免反復(fù)凍融，qPCR Mix短期使用可存放于4℃
Reverse primer每次使用后需立即放回-20℃保存
注意事項(xiàng)
實(shí)驗(yàn)操作需在無RNase環(huán)境中進(jìn)行，使用無菌無酶耗材
配制反應(yīng)體系時(shí)需在冰上操作，避免試劑降解
若出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，可適當(dāng)提高退火溫度或優(yōu)化引物濃度
實(shí)驗(yàn)結(jié)果需結(jié)合溶解曲線分析判斷擴(kuò)增特異性
定量檢測需設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)品梯度建議覆蓋5個(gè)數(shù)量級(jí)
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關(guān)鍵字： miRNA加尾染料法熒光定量PCR試劑盒;miRNA Poly(A) Tailin;
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