基本信息?
?中文名稱(chēng)?：miRNA莖環(huán)染料法熒光定量PCR試劑盒
貨號(hào)：P-PR1431
規(guī)格：200反應(yīng)、400反應(yīng)
?英文名稱(chēng)?：miRNA Stem-loop Dye-based Quantitative PCR Kit
作用機(jī)制：設(shè)計(jì)與miRNA序列互補(bǔ)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)錄引物，該引物與miRNA特異性結(jié)合后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，生成含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的cDNA，再用特異性引物對(duì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)染料與擴(kuò)增的雙鏈DNA結(jié)合產(chǎn)生的熒光信號(hào)定量miRNA。
適用樣本：含miRNA的總RNA樣本，如動(dòng)植物組織總RNA、細(xì)胞系總RNA、體液總RNA等。
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
本試劑盒專(zhuān)為miRNA定量檢測(cè)設(shè)計(jì)，采用SYBR Green I嵌合熒光法，搭配莖環(huán)引物技術(shù)，解決miRNA片段短、易非特異擴(kuò)增的痛點(diǎn)。試劑盒組成完整，包含2×miRNA SYBR Master mix、Tag Primer、ddH?O，可滿(mǎn)足多次實(shí)驗(yàn)需求，無(wú)需額外搭配基礎(chǔ)試劑。
核心優(yōu)勢(shì)
特異性強(qiáng)：熱啟動(dòng)聚合酶+莖環(huán)引物設(shè)計(jì)雙重保障，有效避免引物二聚體和非特異擴(kuò)增，精準(zhǔn)靶向miRNA
靈敏度高：優(yōu)化后的反應(yīng)緩沖液提升PCR擴(kuò)增效率，熒光信號(hào)更強(qiáng)，靈敏度優(yōu)于同類(lèi)產(chǎn)品，適合低豐度miRNA檢測(cè)
便捷性好：購(gòu)買(mǎi)即免費(fèi)提供上下游引物設(shè)計(jì)和序列信息，無(wú)需自行摸索，大幅提升實(shí)驗(yàn)成功率
試劑盒組成
組分 規(guī)格（200T） 保存條件
2×miRNA SYBR Master mix 10mL -20℃避光保存
Tag Primer 1mL -20℃避光保存
ddH?O 10mL -20℃保存
注：所有組分無(wú)核酸酶殘留，僅用于科研；單次使用量較少時(shí)，建議小份分裝保存，避免反復(fù)凍融
實(shí)驗(yàn)步驟
一、miRNA逆轉(zhuǎn)錄（需搭配莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒）
配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（10μL體系）：
5×RT Buffer：2μL
RT Enzyme Mix：0.5μL
莖環(huán)引物（1μM）：1μL
總RNA樣本：1-5μL
RNase-free Water：補(bǔ)至10μL
逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序：
16℃ 30分鐘
42℃ 30分鐘
85℃ 5分鐘
4℃ 保存
二、熒光定量PCR檢測(cè)
配制PCR反應(yīng)體系（20μL體系）：
2×miRNA SYBR Master mix：10μL
上游引物（10μM）：0.4μL
下游引物（10μM）：0.4μL
cDNA模板：2μL
ddH?O：7.2μL
PCR擴(kuò)增程序（3段法）：
95℃ 10分鐘（激活聚合酶）
95℃ 10秒 → 60℃ 20秒 → 70℃ 20秒（收集熒光信號(hào)），40個(gè)循環(huán)
溶解曲線(xiàn)分析：95℃ 15秒 → 60℃ 1分鐘 → 95℃ 15秒
注意事項(xiàng)
防污染：qPCR靈敏度極高，氣溶膠污染會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性，所有操作需在超凈臺(tái)中進(jìn)行，使用專(zhuān)用槍頭和離心管
模板質(zhì)量：確保模板無(wú)蛋白酶、核酸酶污染，濃度均勻，避免因模板降解或濃度過(guò)高/過(guò)低導(dǎo)致擴(kuò)增異常
反應(yīng)條件：根據(jù)引物Tm值、目標(biāo)片段長(zhǎng)度調(diào)整退火溫度和延伸時(shí)間，復(fù)雜樣本可適當(dāng)優(yōu)化循環(huán)數(shù)
試劑保存：所有試劑需-20℃避光保存，反復(fù)凍融會(huì)破壞酶活性和熒光物質(zhì)，建議小份分裝使用
操作規(guī)范：配制反應(yīng)體系時(shí)輕柔混勻，防止氣泡產(chǎn)生；避免強(qiáng)光照射試劑
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