導讀： 流感嗜血桿菌是引起社區(qū)獲得性肺炎、腦膜炎和中耳炎的重要病原體，其藥敏試驗因?qū)ε囵B(yǎng)基和培養(yǎng)條件的特殊要求而具有較高的技術難度。ATCC 49247作為CLSI指定的流感嗜血桿菌藥敏質(zhì)控標準菌株，在該菌的體外藥敏評價體系中扮演著不可替代的角色。本文重點介紹嗜血桿菌藥敏的特殊技術要求及該菌株的質(zhì)控應用。

菌株基本信息

ATCC 49247的學名為 Haemophilus influenzae，是一株β-內(nèi)酰胺酶陰性的氨芐西林敏感菌株（BLNAR-negative）。該菌株在CLSI M100中被指定為流感嗜血桿菌藥敏試驗的標準質(zhì)控菌，覆蓋β-內(nèi)酰胺類、氟喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類等多個藥物類別。

| 項目 | 內(nèi)容 |

|------|------|

| 學名 | Haemophilus influenzae |

| ATCC編號 | 49247 |

| 生物安全等級 | BSL-2 |

| 推薦培養(yǎng)基 | HTM（Haemophilus Test Medium） |

| 培養(yǎng)溫度 | 35±2°C |

| CO?需求 | 5% CO? |

| 關鍵特征 | β-內(nèi)酰胺酶陰性，氨芐西林敏感 |

生物學特性與形態(tài)

ATCC 49247為革蘭陰性小桿菌（球桿菌），在巧克力瓊脂（含X因子和V因子）上35°C、5% CO?培養(yǎng)18-24小時后，菌落小、光滑、灰白色、透明。該菌氧化酶陽性、卟啉試驗（ALA）陰性——后者說明它需要外源X因子（血紅素）才能生長。

嗜血桿菌的生長依賴兩種輔因子：X因子（血紅素/氯化血紅素）和V因子（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸/NAD）。這一特性直接決定了藥敏試驗培養(yǎng)基的特殊要求——普通MHA不含X和V因子，不支持嗜血桿菌生長。

培養(yǎng)條件與操作要點

HTM培養(yǎng)基——嗜血桿菌藥敏的專用培養(yǎng)基

CLSI M100明確規(guī)定，流感嗜血桿菌藥敏試驗必須使用HTM（Haemophilus Test Medium），而非普通MHA。HTM的組成：

• Mueller-Hinton瓊脂基礎

• 添加酵母提取物（5 g/L）

• 添加β-NAD（V因子，15 μg/mL）

• 添加牛血紅素（X因子，15 μg/mL）

• pH 7.2-7.4

HTM的商業(yè)化產(chǎn)品可從主要培養(yǎng)基供應商處購買預制平板。如果實驗室自行配制，X因子和V因子的添加濃度必須精確控制——濃度不足會導致嗜血桿菌生長不良，濃度過高則可能影響某些抗生素的活性。

接種與培養(yǎng)

1. 從巧克力瓊脂平板上挑取新鮮菌落（24小時以內(nèi)），懸浮于生理鹽水中

2. 調(diào)整濁度至0.5號麥氏標準

3. 用棉簽在HTM平板上密涂三遍

4. 室溫放置3-5分鐘，貼抗生素紙片

5. 在5% CO?環(huán)境中35°C培養(yǎng)16-18小時

特別注意： 嗜血桿菌必須在CO?環(huán)境中培養(yǎng)，這是與前述革蘭陰性桿菌藥敏試驗的最大區(qū)別。CO?濃度的波動可能影響某些藥物的抑菌圈大小，因此CO?培養(yǎng)箱的濃度校準非常重要。

在各標準中的應用

CLSI M100中的應用

K-B法（HTM平板）質(zhì)控抑菌圈范圍：

| 抗生素 | 紙片含量 | 抑菌圈范圍(mm) |

|--------|----------|---------------|

| 氨芐西林 | 10μg | 19-25 |

| 阿莫西林/克拉維酸 | 20/10μg | 19-25 |

| 頭孢呋辛 | 30μg | 20-28 |

| 頭孢噻肟 | 30μg | 30-38 |

| 頭孢他啶 | 30μg | 23-31 |

| 美羅培南 | 10μg | 20-28 |

| 環(huán)丙沙星 | 5μg | 30-40 |

| 阿奇霉素 | 15μg | 13-21 |

| 復方新諾明 | 1.25/23.75μg | 24-32 |

| 氯霉素 | 30μg | 25-31 |

MIC法（HTM肉湯）質(zhì)控范圍（μg/mL）：

| 抗生素 | MIC范圍 |

|--------|---------|

| 氨芐西林 | 0.25-1 |

| 頭孢噻肟 | 0.015-0.06 |

| 頭孢呋辛 | 0.5-2 |

| 美羅培南 | 0.03-0.12 |

| 環(huán)丙沙星 | 0.004-0.03 |

| 阿奇霉素 | 1-4 |

β-內(nèi)酰胺酶檢測

ATCC 49247為β-內(nèi)酰胺酶陰性株。頭孢硝噻吩試驗應為陰性結果。該菌株可用于驗證β-內(nèi)酰胺酶檢測系統(tǒng)的陰性對照端。

對于β-內(nèi)酰胺酶陽性株的質(zhì)控需求，可使用ATCC 49766（產(chǎn)TEM-1型β-內(nèi)酰胺酶的流感嗜血桿菌）。

行業(yè)質(zhì)控用途

嗜血桿菌藥敏室內(nèi)質(zhì)控： 每日進行嗜血桿菌相關藥敏試驗時，同步接種ATCC 49247進行質(zhì)控。

HTM培養(yǎng)基批次驗證： 每批新到的HTM平板須用ATCC 49247驗證，確認抑菌圈在允許范圍內(nèi)——這是對HTM培養(yǎng)基中X因子和V因子含量是否充足的間接檢驗。

BLNAR檢測輔助參考： 氨芐西林耐藥但β-內(nèi)酰胺酶陰性的流感嗜血桿菌（BLNAR）因PBP3突變導致耐藥，頭孢硝噻吩試驗無法檢出。ATCC 49247作為氨芐西林敏感株，可輔助驗證氨芐西林紙片/MIC的基線準確性。

菌種保藏與管理

嗜血桿菌的保藏管理比普通細菌更需注意：該菌在普通MHA斜面上無法存活，工作菌種須保存在巧克力瓊脂斜面上（含X/V因子），2-8°C保存不超過1-2周。推薦-80°C甘油凍存作為長期保存手段。

嗜血桿菌在連續(xù)傳代過程中活力衰減較快，筆者建議每2周從凍存管復蘇一支新工作菌種。

安全注意事項

BSL-2級別。流感嗜血桿菌可引起腦膜炎、肺炎和會厭炎等嚴重感染。操作須在II級生物安全柜內(nèi)進行，特別注意避免氣溶膠產(chǎn)生。

常見問題與工程師建議

Q1：HTM平板和普通巧克力瓊脂在藥敏試驗中可以互換嗎？

不可以。巧克力瓊脂雖然也含X和V因子（通過加熱紅細胞釋放），但其組成未經(jīng)標準化，不同批次的因子含量差異較大，可能導致抑菌圈大小不穩(wěn)定。CLSI明確規(guī)定嗜血桿菌藥敏試驗必須使用HTM，不應使用巧克力瓊脂替代。

Q2：ATCC 49247的抑菌圈整體偏小，如何排查？

首先檢查HTM平板中X因子和V因子的含量——因子含量不足會導致嗜血桿菌生長不良，菌苔薄而不均勻，抑菌圈偏小甚至無法判讀。其次確認CO?濃度（5%±1%），CO?過高會降低某些藥物的活性。最后檢查菌液濁度是否準確。

Q3：BLNAR菌株在藥敏試驗中如何識別？

BLNAR（β-Lactamase Negative Ampicillin-Resistant）菌株頭孢硝噻吩試驗陰性但氨芐西林MIC升高（≥4 μg/mL或紙片法抑菌圈偏?。Ｈ绻鸄TCC 49247的氨芐西林質(zhì)控結果正常（MIC 0.25-1），但患者分離株頭孢硝噻吩陰性而氨芐西林耐藥，應懷疑BLNAR。BLNAR菌株對所有口服β-內(nèi)酰胺類藥物均應報告耐藥。

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杭州康氧醫(yī)療器械有限公司專注于微生物標準菌株、ATCC菌株及相關質(zhì)控產(chǎn)品的供應與技術服務，致力于為制藥企業(yè)、食品檢測機構和科研院所提供可靠的微生物質(zhì)控解決方案。如需了解ATCC標準菌株產(chǎn)品信息或技術支持，官網(wǎng)：www.kystrains.com

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免責聲明： 本文所述菌株信息及技術參數(shù)均來源于ATCC官網(wǎng)、CLSI M100標準、美國藥典(USP)、歐洲藥典(EP)、《中國藥典》2020年版、ISO國際標準及《消毒技術規(guī)范》等公開權威資料，僅供專業(yè)技術參考。具體實驗操作請以產(chǎn)品隨附的質(zhì)檢報告(COA)和說明書為準，并嚴格遵守所在機構的生物安全管理制度。本文不構成任何產(chǎn)品推薦或使用建議。

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