?產(chǎn)品名稱:豬葡萄球菌PCR檢測(cè)試劑盒
英文名稱:Staphylococcus hyicusPCR
貨號(hào):YS-P014771
分類:PCR檢測(cè)試劑盒
規(guī)格?:50T/盒
檢測(cè)原理:
引物靶向豬葡萄球菌毒力相關(guān)保守基因,適配豬源臨床樣本檢測(cè)需求。
樣本核酸經(jīng)提取純化后,在配套 PCR 緩沖液環(huán)境中開展多輪擴(kuò)增反應(yīng)。
通過熒光定量 Ct 閾值判讀,快速區(qū)分豬葡萄球菌陽(yáng)性與陰性樣本。
實(shí)驗(yàn)流程:
(一)反應(yīng)體系配制(冰上操作,防酶失活與污染)
按 “水→緩沖液→dNTP→引物→模板→Taq 酶” 順序加樣(酶最后加,避免失活)。
輕輕渦旋混勻,短暫離心(3000rpm,10s),使液體沉至管底。
無熱蓋的 PCR 儀:加 1 滴礦物油覆蓋液面,防止蒸發(fā)。
(二)PCR 程序設(shè)置(標(biāo)準(zhǔn) 35 循環(huán))
預(yù)變性:94℃,3-5min(徹底變性模板 DNA)。
循環(huán)階段(35 次):
變性:94℃,30s(雙鏈解鏈)。
退火:55-65℃,30s(引物結(jié)合模板,按引物 Tm 值調(diào)整)。
延伸:72℃,1min/kb(Taq 酶合成新鏈,1kb 片段約 1min)。
終延伸:72℃,5-10min(確保片段完整延伸)。
保溫:4℃,∞(防止非特異性復(fù)性,短期保存)。
(三)產(chǎn)物檢測(cè)(瓊脂糖凝膠電泳)
制膠:1% 瓊脂糖凝膠(1g 瓊脂糖 + 100mL 1×TAE 緩沖液),加熱融化后加核酸染料,倒膠插梳,凝固 30min。
上樣:取 5μL PCR 產(chǎn)物 + 1μL 上樣緩沖液,點(diǎn)樣;同時(shí)加 DNA Marker(分子量對(duì)照)。
電泳:120V,20-30min,至溴酚藍(lán)遷移至凝膠 2/3 處。
成像:凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶,目標(biāo)片段位置與預(yù)期一致則為陽(yáng)性。
四、參數(shù)優(yōu)化
退火溫度(Tm):引物 Tm 值 = 4×(G+C)+2×(A+T),退火溫度一般低于 Tm 值 5℃,溫度過高無條帶,過低非特異性條帶多。
Mg2?濃度:1.5-2.5mM,濃度過低酶活性低、產(chǎn)量少;過高非特異性擴(kuò)增增加。
循環(huán)數(shù):25-35 個(gè)循環(huán),少于 25 個(gè)產(chǎn)物不足,多于 35 個(gè)易出現(xiàn)非特異性條帶。
延伸時(shí)間:按目標(biāo)片段長(zhǎng)度調(diào)整,≤1kb 用 1min,1-3kb 用 2-3min。
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注意事項(xiàng):
避免反復(fù)凍融試劑,解凍后需充分混勻。
實(shí)驗(yàn)環(huán)境需嚴(yán)格分區(qū)(試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)、擴(kuò)增區(qū)),防止污染。
陽(yáng)性對(duì)照需與樣本分裝操作。
本產(chǎn)品僅限科研用途,不可用于臨床診斷。
操作時(shí)需穿戴防護(hù)裝備,避免試劑接觸皮膚或眼睛。
樣本采集需遵循無菌原則,運(yùn)輸時(shí)使用干冰或冰袋保存。
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