本試劑盒針對耐萬古霉素腸球菌耐藥基因及特異性核酸序列設(shè)計PCR擴增體系，可快速精準檢出樣本中的耐萬古霉素腸球菌病原。該菌株為臨床高危耐藥菌，易引發(fā)院內(nèi)感染，本試劑盒靈敏度高、特異性強，可實現(xiàn)耐藥菌的快速篩查與鑒定，相較于傳統(tǒng)培養(yǎng)法大幅縮短檢測周期，適用于醫(yī)院院內(nèi)感染監(jiān)測、臨床微生物檢測及耐藥菌流行病學調(diào)研工作。

基礎(chǔ)原理：

引物靶向腸球菌萬古霉素耐藥基因（van 基因），擴增耐藥相關(guān)核酸片段。

提取待測菌株或臨床樣本細菌基因組 DNA，開展 PCR 擴增反應(yīng)。

若擴增出耐藥基因片段，即可判定菌株攜帶耐萬古霉素耐藥元件。

?操作步驟?：

（一）反應(yīng)體系配制（冰上操作，防酶失活與污染）

按 “水→緩沖液→dNTP→引物→模板→Taq 酶” 順序加樣（酶最后加，避免失活）。

輕輕渦旋混勻，短暫離心（3000rpm，10s），使液體沉至管底。

無熱蓋的 PCR 儀：加 1 滴礦物油覆蓋液面，防止蒸發(fā)。

（二）PCR 程序設(shè)置（標準 35 循環(huán)）

預變性：94℃，3-5min（徹底變性模板 DNA）。

循環(huán)階段（35 次）：

變性：94℃，30s（雙鏈解鏈）。

退火：55-65℃，30s（引物結(jié)合模板，按引物 Tm 值調(diào)整）。

延伸：72℃，1min/kb（Taq 酶合成新鏈，1kb 片段約 1min）。

終延伸：72℃，5-10min（確保片段完整延伸）。

保溫：4℃，∞（防止非特異性復性，短期保存）。

（三）產(chǎn)物檢測（瓊脂糖凝膠電泳）

制膠：1% 瓊脂糖凝膠（1g 瓊脂糖 + 100mL 1×TAE 緩沖液），加熱融化后加核酸染料，倒膠插梳，凝固 30min。

上樣：取 5μL PCR 產(chǎn)物 + 1μL 上樣緩沖液，點樣；同時加 DNA Marker（分子量對照）。

電泳：120V，20-30min，至溴酚藍遷移至凝膠 2/3 處。

成像：凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶，目標片段位置與預期一致則為陽性。

四、參數(shù)優(yōu)化

退火溫度（Tm）：引物 Tm 值 = 4×(G+C)+2×(A+T)，退火溫度一般低于 Tm 值 5℃，溫度過高無條帶，過低非特異性條帶多。

Mg2?濃度：1.5-2.5mM，濃度過低酶活性低、產(chǎn)量少；過高非特異性擴增增加。

循環(huán)數(shù)：25-35 個循環(huán)，少于 25 個產(chǎn)物不足，多于 35 個易出現(xiàn)非特異性條帶。

延伸時間：按目標片段長度調(diào)整，≤1kb 用 1min，1-3kb 用 2-3min。

?注意事項?：

避免反復凍融試劑，解凍后需充分混勻。

實驗環(huán)境需嚴格分區(qū)（試劑準備區(qū)、樣本處理區(qū)、擴增區(qū)），防止污染。

陽性對照需與樣本分裝操作。

本產(chǎn)品僅限科研用途，不可用于臨床診斷。

操作時需穿戴防護裝備，避免試劑接觸皮膚或眼睛。

樣本采集需遵循無菌原則，運輸時使用干冰或冰袋保存。

公司正在出售的產(chǎn)品：