BF750標(biāo)記的磷酸化蛋白激酶B抗體
原理特點
本抗體采用BF750近紅外熒光標(biāo)記，該染料抗光漂白能力強、長波長熒光干擾極低，與磷酸化AKT特異性抗體偶聯(lián)，僅識別磷酸化活化態(tài)的蛋白激酶B，不結(jié)合總AKT蛋白。磷酸化AKT是PI3K/AKT信號通路的核心活化指標(biāo)，直接調(diào)控細(xì)胞增殖、代謝、凋亡及腫瘤發(fā)生發(fā)展，該抗體位點特異性極強，可精準(zhǔn)區(qū)分蛋白活化與非活化狀態(tài)，近紅外熒光適配高靈敏度組織成像與多色共聚焦實驗，是信號通路活化水平定量研究的優(yōu)質(zhì)工具。
英文名稱:phospho-AKT1 (Ser473) Rabbit pAb, BF750 conjugated
中文名稱:BF750標(biāo)記的磷酸化蛋白激酶B抗體
英文別名：Akt(phospho-Ser473); AKT(phospho-S473); AKT(phospho Ser473); p-AKT(Ser473); AKT 1; AKT; AKT1; AKT-1; AKT1_HUMAN; C AKT; cAKT; MGC9965; MGC99656; Oncogene AKT1; PKB; PKB alpha; PKB-ALPHA; PRKBA; Protein Kinase B alpha; Protein kinase B; Proto-oncogene c-Akt; RAC alpha; RAC alpha serine/threonine protein kinase; RAC; RAC PK alpha; Rac protein kinase alpha; RAC Serine/Threonine Protein Kinase; RAC-alpha serine/threonine-protein kinase; RAC-PK-alpha; v akt murine thymoma viral oncogene homolog 1; vAKT Murine Thymoma Viral Oncogene Homolog 1.
標(biāo)記物：BF750（近紅外熒光染料 Biorbyt 系列，長波長，背景低、多色流式兼容）
靶標(biāo)：磷酸化 AKT（Ser473/Thr308 位點，活化型蛋白激酶 B）
抗體類型：兔多克隆 IgG
種屬：人、小鼠、大鼠
應(yīng)用：流式 FCM、免疫熒光 IF、ICC
通路功能：PI3K/AKT 增殖存活通路核心，檢測細(xì)胞增殖、耐藥、腫瘤信號激活水平
儲存：-20℃避光分裝，避免反復(fù)凍融
靶點背景
1. AKT（PKB）是 PI3K 下游關(guān)鍵絲氨酸 / 蘇氨酸激酶，磷酸化修飾為其活化形式
2. 活化 AKT 調(diào)控細(xì)胞存活、增殖、糖代謝、血管生成，抑制細(xì)胞凋亡通路
3. 腫瘤、代謝疾病研究核心靶點，檢測通路激活水平、靶向藥藥效評價
核心實驗操作方法
1. Western Blot（WB）
抗體孵育
一抗孵育：用5%脫脂牛奶或BSA稀釋抗體至推薦濃度（如1:1000），4℃搖床緩慢孵育過夜；或室溫孵育1-2小時，孵育時保證膜完全浸沒在抗體溶液中。
洗滌：用TBST緩沖液洗滌3次，每次5分鐘，洗去未結(jié)合的一抗；加入HRP標(biāo)記二抗（1:5000-1:10000稀釋），室溫孵育1小時。
顯影：再次洗滌后，加入ECL發(fā)光液孵育1-2分鐘，用化學(xué)發(fā)光成像儀采集圖像，根據(jù)信號強度調(diào)整曝光時間。
2. 免疫組化（IHC）
抗體孵育
一抗孵育：滴加稀釋后的一抗（如1:200）于組織切片上，置于濕盒中4℃孵育過夜；次日室溫復(fù)溫30分鐘，PBS沖洗3次，每次5分鐘。
二抗結(jié)合：加入生物素標(biāo)記二抗（1:200）室溫孵育30分鐘，PBS沖洗后加入ABC復(fù)合物（1:100）室溫孵育30分鐘。
顯色封片：DAB顯色劑顯色3-10分鐘（顯微鏡下觀察控制時間），蘇木素復(fù)染1分鐘，梯度乙醇脫水后中性樹膠封片。
3. 免疫熒光（IF）
抗體孵育
一抗孵育：用5% BSA稀釋抗體至工作濃度（如1:100），滴加在細(xì)胞爬片上，4℃避光孵育過夜；室溫復(fù)溫后PBS沖洗3次，每次5分鐘。
二抗結(jié)合：加入熒光標(biāo)記二抗（如FITC標(biāo)記抗兔IgG，1:200），室溫避光孵育30-60分鐘；PBS沖洗后用抗淬滅封片液封片。
觀察：熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡下觀察，激發(fā)波長根據(jù)二抗標(biāo)記物選擇（如FITC為488nm）。
4. ELISA實驗
包被與孵育
包被：用包被緩沖液（pH9.6碳酸鹽緩沖液）稀釋抗原至1-10μg/ml，每孔加入100μl，4℃過夜孵育。
封閉與一抗孵育：棄去包被液，PBST洗滌3次，加入5% BSA封閉液200μl/孔，37℃孵育1小時；加入稀釋后的一抗100μl/孔，37℃孵育1-2小時或4℃過夜。
檢測：洗滌后加入酶標(biāo)二抗（1:5000），37℃孵育1小時；TMB底物溶液顯色10-30分鐘，2M硫酸終止反應(yīng)后，酶標(biāo)儀450nm波長讀取OD值。
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關(guān)鍵字： BF750標(biāo)記的磷酸化蛋白激酶B抗體;phospho-AKT1 (Ser473;100ul;
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