谷胱甘肽過氧化物酶檢測(cè)試劑盒（DTNB法）
微量法100管48樣
正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
谷胱甘肽過氧化物酶（GPx，EC1.11.1.9）代表一種具有過氧化物酶活性的酶家族，GPx能夠催化還原型谷胱甘肽（GSH）生成氧化型谷胱甘肽（GSSG），使有毒的過氧化氫還原成無(wú)毒的羥基化合物，從而保護(hù)生物膜免受 ROS 的損害，維持細(xì)胞的正常功能，同時(shí)還具有保護(hù)肝臟、提高機(jī)體免疫力、拮抗有害金屬離子對(duì)機(jī)體的傷害和增加機(jī)體抗輻射等作用。
測(cè)定原理：
谷胱甘肽過氧化物酶可催化H2O2氧化GSH生成GSSG，GSH和DTNB反應(yīng)生成黃色的TNB，產(chǎn)物在412nm處具有特征吸收峰，通過吸光值下降速率即可表征谷胱甘肽過氧化物酶的活性。
試劑組成和配制：
產(chǎn)品名稱 | GSH006-100T/48S | Storage |
提取液：液體 | 120mL | 4℃ |
試劑一：粉劑 | 2瓶 | 4℃避光 |
試劑二：液體 | 1瓶 | 4℃避光 |
試劑三：液體 | 20mL | 4℃避光 |
試劑四：液體 | 20mL | 4℃ |
試劑五：粉劑 | 1瓶 | 4℃避光 |
標(biāo)準(zhǔn)品：粉劑 | 一支 | 4℃ |
說明書 | 一份 |
試劑一：臨用前每瓶加入2mL提取液，充分溶解混勻，4℃避光條件下可保存1周。
試劑二工作液：臨用前加入5mL純水，充分混勻，4℃避光條件下可保存2周。
試劑五：臨用前加入2.5mL純水，充分混勻，4℃避光條件下可保存2周。
標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入405μL純水，充分混勻，即為80μmol/mL GSH母液，4℃避光條件下可保存2周。
需自備儀器和用品：
酶標(biāo)儀、電子天平、臺(tái)式離心機(jī)、研缽/勻漿器、可調(diào)式移液器、96孔板、振蕩儀、純水、冰。
樣本處理：
1. 組織：按照組織質(zhì)量(g) : 提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后12000g，4℃，離心10min后取上清置于冰上待測(cè)。
2. 細(xì)菌和細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間
3min）；然后12000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。
3. 血清（漿)、培養(yǎng)液等液體樣本：吸取100μL液體樣本，加入100μL提取液充分混勻，4℃12000g離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。
測(cè)定步驟：
1. 酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上。
2. 酶促反應(yīng)步驟：
試劑名稱(μL) | 測(cè)定管 | 對(duì)照管 |
樣本 | 20 |
|
提取液 |
| 20 |
試劑一 | 20 | 20 |
試劑二工作液 | 10 | 10 |
振蕩混勻，37℃溫育5min |
試劑三 | 100 | 100 |
提取液 | 20 |
|
樣本 |
| 20 |
充分混勻，25℃，4000g離心5min，取上清液進(jìn)行下述顯色反應(yīng)。 |
3. 顯色反應(yīng)步驟
試劑名稱(μL) | 測(cè)定管 | 對(duì)照管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | 空白管 |
上清液 | 40 | 40 |
|
|
標(biāo)準(zhǔn)液 |
|
| 40 |
|
蒸餾水 |
|
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| 40 |
試劑四 | 160 | 160 | 160 | 160 |
試劑五 | 25 | 25 | 25 | 25 |
充分混勻，室溫避光靜置15min。取200μL至96孔板，測(cè)定412nm下的吸光度，分別記為A測(cè)定管、A對(duì)照管、A標(biāo)準(zhǔn)管、A空白管。計(jì)算ΔA測(cè)定=A對(duì)照管-A測(cè)定管，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管。注：空白管和各濃度標(biāo)準(zhǔn)管僅需要測(cè)1-2次，每個(gè)測(cè)定管均需設(shè)置一個(gè)對(duì)照管。 |
酶活性計(jì)算公式：
標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y=1.362x-0.0054，R2=0.9998，x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/mL），y為吸光值。
1.按蛋白濃度計(jì)算：
活性單位定義：在37℃反應(yīng)條件下，每毫克蛋白每分鐘氧化1nmolGSH為1個(gè)酶活單位。
GPx(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0054)÷1.362×103×V反總]÷(Cpr×V樣)÷T=1248.2×(ΔA+0.0054)÷Cpr
2.按樣本質(zhì)量計(jì)算：
活性單位定義：在37℃反應(yīng)條件下，每克樣本每分鐘氧化1nmolGSH為1個(gè)酶活單位。
GPx(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0054)÷1.362×103×V反總]÷(W×V樣÷V提)÷T=1248.2×(ΔA+0.0054)÷W
3.按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：
活性單位定義：在37℃反應(yīng)條件下，每104個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmolGSH為1個(gè)酶活單位。
GPx(nmol/min/104 cell)=[(ΔA+0.0054)÷1.362×103×V反總]÷(500×V樣÷V提)÷T=1248.2×(ΔA+0.0054)÷500
4.按液體體積計(jì)算：
活性單位定義：在37℃反應(yīng)條件下，每毫升液體每分鐘氧化1nmolGSH為1個(gè)酶活單位。
GPx(nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0054)÷1.362×103×V反總]÷V樣÷T=1248.2×(ΔA+0.0054)
V樣：酶促反應(yīng)樣本體積，0.02mL；V反總：酶促反應(yīng)總體積，0.17mL；V提：樣本提取中提取液加入量，1mL；W：樣品質(zhì)量，g ；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；500：細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）；103：1μmol=103nmol；T：反應(yīng)時(shí)間，5min。
注意事項(xiàng)：
1. ΔA線性范圍為0.02-1.3，可測(cè)定剩余谷胱甘肽濃度范圍0.02-1μmol/mL；如果樣本ΔA大于1.3，建議用提取液稀釋待測(cè)樣本后重新測(cè)定（計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)），如果ΔA小于0.05，建議適當(dāng)增加樣本量。
2. 建議一次不要做過多樣本以免檢測(cè)時(shí)間過長(zhǎng)影響顯色，防止測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確。
實(shí)驗(yàn)實(shí)例：
1. 稱取0.2g牛肝，加入1mL提取液研磨勻漿，取上清用提取液梯度稀釋，后按測(cè)定步驟操作，結(jié)果如下：
樣本質(zhì)量 （牛肝） | 0.1g | 0.05g | 0.025g |
A測(cè)定 | 0.385 | 0.489 | 0.555 |
A對(duì)照 | 0.628 | 0.637 | 0.632 |
ΔA （A對(duì)照-A測(cè)定） | 0.243 | 0.148 | 0.077 |
GPx酶活 (nmol/min/g 鮮重) | 3100.52 | 3829.47 | 4144.07 |
2. 稱取0.1g現(xiàn)取紫葉李葉片，加入1mL提取液研磨勻漿，取上清用提取液梯度稀釋，后按測(cè)定步驟操作，結(jié)果如下：
樣本質(zhì)量 （葉片） | 0.1g | 0.05g |
A測(cè)定 | 0.619 | 0.624 |
A對(duì)照 | 0.657 | 0.646 |
ΔA （A對(duì)照-A測(cè)定） | 0.038 | 0.022 |
GPx酶活 (nmol/min/g 鮮重) | 541.72 | 684.01 |
參考文獻(xiàn)：
[1]Flohé L, Günzler W A. [12] Assays of glutathione peroxidase[M]. Methods in enzymology. Academic Press, 1984, 105: 114-120.
[2]楊繼軒, 任治鵬, 徐悅, 等. 幾種禾本科作物幼苗期谷胱甘肽過氧化物酶活力研究[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2018 (5): 1-3.
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關(guān)鍵字： DTNB比色法;谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)測(cè)試盒;谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)活性檢測(cè)試劑;
伊勢(shì)久（江蘇連云港）生物科技有限責(zé)任公司，成立于2019年，坐落于新亞歐大陸橋東方橋頭堡連云港市。公司由資深行業(yè)專家和雙一流高校博士聯(lián)合創(chuàng)辦，主要從事生化檢測(cè)、病理檢測(cè)和原料酶等相關(guān)試劑的研發(fā)和生產(chǎn)。
我司位于聯(lián)東U谷科技創(chuàng)新谷內(nèi)的2000平米的生產(chǎn)、研發(fā)基地已建成投入運(yùn)行，其中包括150平米的超十萬(wàn)級(jí)的潔凈車間。我司堅(jiān)持以自主研發(fā)為核心，現(xiàn)已生產(chǎn)出的脲酶、tRNA轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸、刀豆球蛋白、胰蛋白酶抑制劑等產(chǎn)品，熱銷市場(chǎng)以來收到了客戶的廣泛好評(píng)。
公司秉承“ 摯誠(chéng)科研、匠心傳承” 的發(fā)展理念，聚焦于前沿生物技術(shù)的應(yīng)用和創(chuàng)新，努力成為生物科技領(lǐng)域的標(biāo)桿企業(yè)。堅(jiān)持以客戶為中心，致力于為中國(guó)的科研工作者提供高品質(zhì)的產(chǎn)品和專業(yè)服務(wù)，始終是我們努力的目標(biāo)和方向。