背景及概述[1][3]
新生牛血清是指從出生14小時內未進食的新生牛體上采血，分離血清，并經(jīng)除菌 過濾后制成的犢牛血清，也有人稱之為小牛血清?！吨腥A人民共和國藥典》(以下簡稱《藥 典》)三部附錄中規(guī)定，新生牛血清的各項檢測指標應符合以下標準：①總蛋白含量：3.5％- 5.0％；②血紅蛋白：不高于0.02％；③大腸桿菌噬菌體：不得有噬菌體污染；④滲透壓摩爾 濃度：250-400mOsmol/kg；⑤無菌檢查：陰性；⑥支原體檢查：陰性；⑦細菌內毒素：不高于 10EU/ml；⑧病毒檢查：陰性；⑨支持細胞增殖檢查-(Sp2/0-Ag14)：生長曲線(接種濃度)最 大增殖濃度≥1.0×106個/ml，細胞倍增時間≤20h，克隆率≥70％。
新生牛血清具有豐富的營養(yǎng)物質，在細胞培養(yǎng)基中加入適量新生牛血清可 以補充細胞生長所需的生長因子、激素、貼附因子等；新生牛血清還具有解毒作用，能解除脂肪酸、重金屬和某些蛋白酶的毒性；此外，新生牛血清還具有抑制胰蛋白酶 的作用，可以保護細胞免受機械損傷。因此，新生牛血清對細胞的生長有重要促進作 用，是細胞培養(yǎng)基的重要組成部分。
牛血清是細胞培養(yǎng)中用量的天然培養(yǎng)基，含有豐富的細胞生長必須的營養(yǎng)成份，常用于動物細胞的體外培養(yǎng)，具有極為重要的功能。它提供對維持細胞指數(shù)生長的激素，基礎培養(yǎng)基中沒有或量很少的營養(yǎng)物，以及主要的低分子營養(yǎng)物。它還能夠提供結合蛋白，能識別維生素、脂類、金屬和其他激素等，能結合或調變它們所結合的物質活力；有些情況下結合蛋白質能與有毒金屬和熱原質結合，起到解毒作用。牛血清還是細胞貼壁、鋪展在塑料培養(yǎng)基質上所需因子來源。另外牛血清還起酸堿度緩沖液作用以 及提供蛋白酶抑制劑，使在細胞傳代時使剩余胰蛋白酶失活，保護細胞不受傷害。
制備[3-4]
一、一種去除免疫球蛋白的新生牛血清生產(chǎn)方法：
1.新生牛血清采集：
首先對新生牛血清來源的牛群進行健康狀況調查，選擇無特定病原的黑白花奶牛生下的健康新生公牛(新生公牛不能吃初乳)，通過無菌手術的方法在新生公牛頸靜脈采血，將采集到的新生牛血液用大容量冷凍離心機分離血清，將分離得到的牛血清置?20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>
2.新生牛血清過濾：
將冷凍保存的新生牛血清解凍后進行過濾。
①次過濾新生牛血清，選取膜孔徑0.2微米、膜管面積0.5m2的陶瓷復合膜過濾裝置，膜管置高溫蒸汽壓力滅菌鍋內，在蒸汽溫度120℃、壓力0.1MPa條件下滅菌30分鐘，待膜管冷卻至常溫時過濾新生牛血清，過濾時，調節(jié)回流管閥門控制回流液流量，使膜管進口流體壓力與出口流體壓力差保持在0.2MPa，流體溫度≤40 ℃；將收集得到的濾液立即進行第二次過濾。
②第二次過濾新生牛血清，選取膜孔徑0.1微米、膜管面積0.5m2的陶瓷復合膜 過濾裝置，膜管置高溫蒸汽壓力滅菌鍋內，在蒸汽溫度120℃、壓力0.1MPa條件下 滅菌30分鐘，待膜管冷卻至常溫時過濾新生牛血清，過濾時，調節(jié)回流管閥門控制 回流液流量，使膜管進口流體壓力與出口流體壓力差保持在0.2MPa，流體溫度≤40 ℃；將收集得到的濾液立即進行第三次過濾。
③第三次過濾新生牛血清，選取孔徑0.05微米、膜管面積0.5m2的陶瓷復合膜過濾裝置，膜管置高溫蒸汽壓力滅菌鍋內，在蒸汽溫度120℃、壓力0.1MPa條件下滅菌30分鐘，待膜管冷卻至常溫時過濾新生牛血清，過濾時，調節(jié)回流管閥門控制回流液流量，使膜管進口流體壓力與出口流體壓力差保持在0.2MPa，流體溫度≤40 ℃；收集得到的濾液為無免疫球蛋白新生牛血清。
3.膜過濾后的新生牛血清產(chǎn)品檢測
感官判斷：
取新生牛血清樣品透光觀察新生牛血清液體有無混有異物及判斷液體澄明度，襯 白色背景觀察新生牛血清樣品顏色，注意有無溶血。
無菌檢驗：
(1)需氧菌的檢測：抽取8份新生牛血清樣品，將新生牛血清接種于含5％鮮兔 血酪胨瓊脂斜面2支，每支接種新生牛血清0.2毫升，1支置于37℃，1支置于25℃；另用1支葡萄糖蛋白胨水(G.P)，接種0.2毫升，置25℃，均培養(yǎng)5天，觀察有無細菌生長。
(2)厭氧菌的檢測：抽取8份新生牛血清樣品，將新生牛血清接種于厭氣肉肝湯1 支，接種新生牛血清0.2毫升，置于37℃培養(yǎng)3天，觀察有無菌生長。
支原體檢測：
抽取8份新生牛血清樣品，將新生牛血清接種于改良Frey氏液體培養(yǎng)瓶2管，每瓶含培養(yǎng)液10毫升，接種新生牛血清0.2毫升，放37℃培養(yǎng)，每天觀察有無顏色變化。如在5?7天內未見變化再從培養(yǎng)瓶取0.5毫升接種于含培養(yǎng)液30毫升的培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)觀察，如此重復3次，若無變化則在最后一次接種的培養(yǎng)管經(jīng)14天觀 察，若無顏色變化為無支原體污染血清。
細菌內毒素檢測：
抽取3份新生牛血清樣品，使用廈門市鱟試劑試驗廠生產(chǎn)的內毒素檢測試劑盒(終點顯色法)檢測新生牛血清內毒素含量。
免疫球蛋白含量測定：
抽取3份新生牛血清樣品，使用南京建成生物工程研究所提供的血清總蛋白質含量檢測試劑盒(雙縮脲法)和血清白蛋白含量檢測試劑盒(溴甲酚綠法)，分別檢測新生牛血清總蛋白質含量和新生牛血清白蛋白含量。血清免疫球蛋白含量＝血清總蛋白質含量?血清白蛋白含量。
牛病毒性腹瀉/黏膜病(BVDV/MDV)抗體檢測：
抽取3份新生牛血清樣品，使用IDEXX公司提供的HerdChek牛病毒性腹瀉抗體檢測試劑盒(ELISA法)檢測牛病毒性腹瀉/黏膜病(BVDV/MDV)抗體。
細胞生長曲線峰值檢測：
(1)取生長良好接近匯合的細胞，用胰酶消化，用新培養(yǎng)基制成細胞懸液后計 數(shù)。
(2)將細胞以2×104濃度接種于2個24孔板，分別用含10％新生牛血清血清的 DMEM，37℃、5％二氧化碳、飽和濕度下進行培養(yǎng)。
(3)24h后開始計數(shù)細胞，以后每隔24h計數(shù)一次，每次取3孔細胞，分別進 行計數(shù)。計算平均值，連續(xù)計數(shù)8d。
(4)根據(jù)細胞計數(shù)結果，以單位細胞數(shù)(細胞數(shù)/mL)為縱坐標，以時間為橫坐 標繪制生長曲線。
細胞倍增時間檢測：
按生長曲線計算細胞的倍增時間。取細胞峰值前一天計得的數(shù)(Y)、接種細胞 數(shù)(X)及生長時間(T)計算。
倍增時間＝T/A A＝log2Y/X
細胞克隆率檢測：
(1)取對數(shù)生長期SP2/0細胞，用0.25％胰蛋白酶消化，待細胞收縮變圓，用 吸管吹打，制成單個細胞懸液。
(2)對細胞計數(shù)，并對其倍數(shù)稀釋。
(3)進一步稀釋，使?jié)舛葹?0細胞/ml。
(4)將細胞接種于兩塊96孔板，每孔加入0.1ml，分別用含10％小牛血清和胎 牛血清的DMEM進行培養(yǎng)。
(5)24h后用顯微鏡觀察各孔細胞數(shù)，挑選只含一個細胞的孔，做好標記并進行記錄。
(6)對標記孔進行觀察并持續(xù)培養(yǎng)。
(7)培養(yǎng)兩周后，記數(shù)含單克隆的培養(yǎng)孔數(shù)。
克隆率＝含單克隆培養(yǎng)孔數(shù)目/培養(yǎng)24h含單個細胞的培養(yǎng)孔數(shù)目×100％
4.膜過濾后的新生牛血清檢測結果
外觀性狀：淡黃色澄明液體、無溶血
無菌檢驗：無需氧菌和厭氧菌生長
支原體檢測：無支原體污染
細菌內毒素檢測：細菌內毒素＜0.1Eu/ml
免疫球蛋白含量：免疫球蛋白含量＜0.01mg/ml
牛病毒性腹瀉/黏膜病(BVDV/MDV)抗體：陰性
細胞濃度：1.86×106
SP2/0細胞倍增時間：3.12h
單克隆效率：50/66×100％＝75.8％
二、新生牛血清的生產(chǎn)工藝，包括以下步驟：
(1)、選取淺黃色、澄清且 粘稠的原料血清，原料血清采集自出生14小時內未進食的新生牛中，上述原料血清pH 值為6.8～8.0，蛋白質含量為3.5％～5.0％，細菌內毒素低于10EU/mL，將原料血清在 低于-15℃的條件下進行入庫保存。
(2)、將原料血清移入融化間進行融化，融化間的不銹鋼多層架先擦洗干凈，再用75％酒精清潔消毒，融化間溫度為18～26℃，待融化狀態(tài)為98％左右，實時巡查剔除破 漏血袋。采用純凈水對原料血清包裝袋進行清洗，然后在-5℃～-2℃的條件下保存。
(3)、采用純化水對原料血清包裝袋進行清洗后，再采用注射用水清洗，最后在質 量濃度為75％的酒精中浸泡30分鐘消毒。
(4)、將消毒后的原料血清包裝袋進行無菌剪口，用100目不銹鋼網(wǎng)進行粗濾并存 放于收集瓶中，每瓶取樣10ml進行細菌內毒素檢查。粗濾后的血清在-2℃～2℃的條件下保存。
(5)、將粗濾后的血清用0.45μm的濾膜進行澄清過濾，澄清后的血清在低于-15℃的條件下速凍，待20％冰凍后，血清在-5℃～-2℃的條件下保存。在澄清過濾前，采用生理鹽水進行系統(tǒng)平衡，平衡后的流出物取樣進行pH值和細菌內毒素檢測，pH值為 6.8～8.0，細菌內毒素低于10EU/mL。
(6)、將速凍后的血清注入滅菌后的混合罐中，在混合罐中進行攪拌，攪拌速度為15～20轉/min，攪拌時間為60～70min?；旌瞎奘褂们霸诰€濕熱高壓滅菌、溫度121℃、60分鐘、壓力0.23Mpa，血清入罐前排放罐體及管道蒸汽冷凝水。
(7)、將攪拌后的血清注入筒式過濾器中進行除菌過濾，濾芯孔徑為0.1μm，在筒 式過濾器中并聯(lián)裝載有3～7根濾芯，本實施例中裝載有5根濾芯，除菌過濾后的血清 通過過渡罐進入自動灌裝線進行分裝；
(8)、將分裝后的血清進行抽樣檢驗，檢驗項目包括：
蛋白質含量測定：應為3.5％～5.0％(W/V)，方法按《中華人民共和國藥典》現(xiàn)行 三版(附錄VIB凱式定氮法)進行。
血紅蛋白含量測定：應不高于0.02％。方法按《中華人民共和國藥典》現(xiàn)行三版(附錄XⅢD新生牛血清檢定要求，氰化高鐵法或其他適宜的方法測定)進行。
大腸桿菌噬菌體測定：不得有噬菌體污染。方法按《中華人民共和國藥典》現(xiàn)行三 版(附錄XⅢD新生牛血清檢定要求，噬斑法和增殖法檢測)進行。
滲透壓摩爾濃度測定：應為250～400mOsmol/kg。方法按《中華人民共和國藥典》現(xiàn)行三版(附錄VH)進行。
無菌檢查：應無菌生長。方法按《中華人民共和國藥典》現(xiàn)行版三部(附錄XⅡA) 項進行。
支原體檢查：原體檢查陰性。方法按《中華人民共和國藥典》現(xiàn)行版三部(XⅡB 直接培養(yǎng)法和DNA熒光染色法)進行。
細菌內毒素測定：應不高于10EU/ml。方法按《中華人民共和國藥典》現(xiàn)行三版(附錄XⅡE凝膠限度試驗)進行。
病毒檢查：1)細胞培養(yǎng)法：應符合規(guī)定。方法按《中華人民共和國藥典》現(xiàn)行三 版(附錄XⅢD新生牛血清檢定要求)進行。
2)免疫熒光抗體檢查法：結果應均為陰性。方法按《中華人民共和國藥典》現(xiàn)行 三版(附錄XⅢD新生牛血清檢定要求)進行。
支持細胞增殖檢查：
1)細胞生長曲線的測定：細胞的增殖濃度應不低于1ml含106個細胞。
2)細胞倍增時間的測定：細胞的倍增時間不得超過20小時。
3)克隆率的測定：應不低于70％。
以上方法按《中華人民共和國藥典》現(xiàn)行三版(附錄XⅢD新生牛血清檢定要求) 進行。
(9)、對檢查合格后的產(chǎn)品進行包裝。
去除內毒素[2]
CN201410007483.8公開了一種去除新生牛血清內毒素的工藝，步驟如下：取新生牛血清，4000r/min離心10min，取上清，加入上清液質量0.2%的活性炭進行吸附，吸附30min；吸附后，4000r/min離心20min，取上清，依次用0.8μm濾膜、0.65μm濾膜、0.45μm濾膜、0.22μm濾膜、0.1μm濾膜過濾，即得到去除了內毒素的新生牛血清。本發(fā)明采用活性炭吸附及逐級過濾的方法，可顯著降低以往在新生牛血清生產(chǎn)過程中作為廢棄物的高內毒素含量牛血清中內毒素的含量，增加新生牛血清生產(chǎn)的效率和附加值。
主要參考資料
[1] [中國發(fā)明,中國發(fā)明授權] CN201510957853.9 一種鑒定新生牛血清質量的方法
[2] CN201410007483.8一種去除新生牛血清內毒素的工藝
[3] [中國發(fā)明,中國發(fā)明授權] CN201110151000.8 一種去除免疫球蛋白的新生牛血清生產(chǎn)方法
[4] [中國發(fā)明,中國發(fā)明授權] CN201410341070.3 一種新生牛血清的生產(chǎn)工藝