背景[1-4]
熒光定量PCR引物是指在熒光定量PCR核苷酸聚合作用起始時，刺激合成的一種具有特定核苷酸序列的大分子，與反應物以共價鍵形式連接，這樣的分子稱為引物。引物通常是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個引物與靶區(qū)域一端的一條DNA模板鏈互補，另一個引物與靶區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補，其功能是作為核苷酸聚合作用的起始點，核酸聚合酶可由其3端開始合成新的核酸鏈。
體外人工設計的引物被廣泛用于聚合酶鏈反應、測序和探針合成等。
引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個引物與目的基因一端的一條DNA模板鏈互補，另一個引物與目的基因另一端的另一條DNA模板鏈互補。在PCR（聚合酶鏈式反應）技術中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根據(jù)這一序列合成引物，利用PCR擴增技術，目的基因DNA受熱變性后解鏈為單鏈，引物與單鏈相應互補序列結(jié)合，然后在DNA聚合酶作用下進行延伸，如此重復循環(huán)，延伸后得到的產(chǎn)物同樣可以和引物結(jié)合。
熒光定量PCR技術是指在PCR反應體系中加入熒光基團，通過熒光信號不斷累積而實現(xiàn)實時監(jiān)測PCR全程，然后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在實時熒光定量PCR中，對全程PCR擴增過程進行實時檢測，根據(jù)反應時間和熒光信號的變化可以繪制成一條曲線。
實時熒光定量常用的熒光化學分類有SYBR Green I法和Tag Man探針法。
①SYBR Green I法：SYBR Green I是一種具有綠色激發(fā)波長的染料，吸收波長約為497 nm，發(fā)射波長約為520 nm，可以和所有的dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域結(jié)合。因為在游離狀態(tài)下SYBR Green I發(fā)出的熒光較弱，但是當它與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光就會大大增強，而且熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。此法的優(yōu)點是它可以監(jiān)測任何dsDNA序列的擴增，檢測方法較為簡單，成本較低，但也正是由于熒光染料能和任何dsDNA結(jié)合，如非特異性擴增產(chǎn)物和引物二聚體也能與染料結(jié)合而產(chǎn)生熒光信號，使實驗產(chǎn)生假陽性結(jié)果，因此其特異性不如探針法。因為非特異性產(chǎn)物和引物二聚體的變性溫度要比目標產(chǎn)物的低，所以可以在熔解曲線反應過程中利用軟件分析儀器收集到信號進行鑒別。
②TaqMan探針法：TaqMan探針法是具有高度特異性的定量PCR技術。它的工作原理是在PCR反應體系中存在一對PCR引物和一條探針，探針的5′端標記有報告基團，3′端標記有熒光淬滅基團，探針只與模板特異結(jié)合，其結(jié)合位點在兩條引物之間。當探針完整的時候，報告基團的熒光能量被淬滅基團吸收，所以儀器搜集不到信號，隨著反應的進展，Taq酶遇到探針，利用3′→5′外切核酸酶的活性把探針切斷，導致報告基團的熒光能量不能被淬滅基團吸收，產(chǎn)生了熒光信號，因此信號的強度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。
應用[5][6]
用于熒光定量PCR快速檢測登革1型病毒
登革病毒主要通過埃及伊蚊和白紋伊蚊等媒介昆蟲傳播,引起登革熱以及發(fā)病率和死亡率很高的登革出血熱和登革休克綜合征。登革病毒病流行于熱帶和亞熱帶地區(qū),每年約有5000萬至1億人感染,是一種分布廣、發(fā)病多、危害較大的人類傳染病,已成為全球公共衛(wèi)生關注的焦點之一。
隨著分子生物學技術的飛速發(fā)展,實時熒光定量PCR技術在生物學研究中的應用越來越廣泛。實時熒光定量PCR技術是指在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。它在常規(guī)PCR基礎上添加了熒光染料或熒光探針。熒光染料能特異性摻入DNA雙鏈,發(fā)出熒光信號,而不摻入雙鏈中的染料分子不發(fā)出熒光信號,從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物增加完全同步。熒光探針法是將熒光共振能量傳遞技術應用于常規(guī)PCR中,在探針的5,端標記一個熒光報告基團(R),3,端標記一個淬滅基團(Q),兩者可構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu),即5,端熒光基團所發(fā)出的熒光可被淬滅基團吸收或抑制；當兩者距離較遠時,抑制作用消失,報告基團熒光信號增強,熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號。
利用以上熒光產(chǎn)生原理,在PCR過程中可以連續(xù)不斷地檢測反應體系中熒光信號的變化。當信號增強到某一域值(PCR反應的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號,域值的缺省設置為3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍)時,Ct值被記錄下來。C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含義是：每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。在這一技術的發(fā)展過程中,兩個重要的發(fā)現(xiàn)起著關鍵的作用。
參考文獻
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