背景[1-6]
熒光定量PCR引物是指在核苷酸聚合作用起始時，刺激合成的一種具有特定核苷酸序列的大分子，與反應(yīng)物以共價鍵形式連接，這樣的分子稱為引物。引物通常是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個引物與靶區(qū)域一端的一條DNA模板鏈互補，另一個引物與靶區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補，其功能是作為核苷酸聚合作用的起始點，核酸聚合酶可由其3端開始合成新的核酸鏈。
體外人工設(shè)計的引物被廣泛用于聚合酶鏈反應(yīng)、測序和探針合成等。實時熒光定量PCR是利用熒光染料（具有雙鏈DNA親和性）或熒光標記短核苷酸探針（利用Taq酶的5’→3’外切酶活性）的熒光活性，在PCR反應(yīng)的的過程中，每個循環(huán)收集一個熒光強度信號。隨著PCR反應(yīng)產(chǎn)物量的增加，熒光信號強度也等比例增強。RT-qPCR反應(yīng)完成后通過對PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)后熒光信號強度變化的監(jiān)測可得到一條熒光擴增曲線圖，進一步可計算出相對應(yīng)的產(chǎn)物量的變化，從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。
引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個引物與目的基因一端的一條DNA模板鏈互補，另一個引物與目的基因另一端的另一條DNA模板鏈互補。在PCR（聚合酶鏈式反應(yīng)）技術(shù)中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根據(jù)這一序列合成引物，利用PCR擴增技術(shù)，目的基因DNA受熱變性后解鏈為單鏈，引物與單鏈相應(yīng)互補序列結(jié)合，然后在DNA聚合酶作用下進行延伸，如此重復(fù)循環(huán)，延伸后得到的產(chǎn)物同樣可以和引物結(jié)合。
PCR引物設(shè)計的目的是找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。如前述，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。對引物的設(shè)計不可能有一種包羅萬象的規(guī)則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設(shè)計。
引物設(shè)計有3條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補，其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，再次引物不能在模板的非目的位點引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(即錯配)。
具體實現(xiàn)這3條基本原則需要考慮到諸多因素，如引物長度（primer length），產(chǎn)物長度（product length），序列Tm值(melting temperature)，引物與模板形成雙鏈的內(nèi)部穩(wěn)定性(internal stability,用?G值反映)。
形成引物二聚體(primer dimer)及發(fā)夾結(jié)構(gòu)（duplexformation and hairpin）的能值，在錯配位點（false priming site）的引發(fā)效率，引物及產(chǎn)物的GC含量（composition），等等。必要時還需對引物進行修飾，如增加限制性內(nèi)切酶位點，引進突變等。
應(yīng)用[7][8]
熒光定量PCR引物可用于熒光定量PCR檢測實驗：
熒光定量PCR方法為技術(shù)基礎(chǔ),建立了一種能單管同時鑒別三種動物衣原體的TaqMan-MGB探針多重?zé)晒舛縋CR方法,該方法特異、靈敏且穩(wěn)定性良好。主要研究內(nèi)容包括以下幾方面：
1、通過對GenBank中衣原體科的9種衣原體主要外膜蛋白序列進行比對分析,應(yīng)用Primer Express3.0生物學(xué)軟件設(shè)計了3對特異的引物,3條探針和1對通用引物。采用通用引物進行PCR擴增,構(gòu)建陽性質(zhì)粒,將其陽性質(zhì)粒測序結(jié)果與GenBank中已發(fā)表的主要外膜蛋白序列進行比對。結(jié)果表明：構(gòu)建的陽性質(zhì)粒與GenBank中發(fā)表的主要外膜蛋白序列相似性分別達達99%、97%、96%。
2、通過對三種衣原體(家畜嗜衣原體、流產(chǎn)嗜衣原體、鸚鵡熱衣原體)的單重?zé)晒舛縋CR引物濃度、探針濃度和Tm值的優(yōu)化,分別建立了家畜嗜衣原體、流產(chǎn)嗜衣原體、鸚鵡熱衣原體的單重?zé)晒舛縋CR檢測方法。并進行了相應(yīng)的特異性試驗、靈敏度試驗,建立了相應(yīng)的標準曲線。動物衣原體病((Chlamydiosis)是由各類衣原體(Chlamydia)感染哺乳動物、禽類等動物所發(fā)生的一類十分重要的自然疫源性傳染病。該病呈地方流行,常造成較大的危害及經(jīng)濟損失。
目前針對的衣原體的檢測方法有細胞培養(yǎng)法、間接血凝試驗(1HA)、直接染色觀察等方法,但以上檢測方法對于快速準確的檢測衣原體尚存在較大的局限,如細胞培養(yǎng)法容易受到支原體的污染、靈敏度較低；間接血.凝試驗雖然操作比較簡單,但批次間差異較大、陽性檢出率較低；直接染色觀察靈敏度較低。因此,急需建立一種快速、簡捷、特異、靈敏、穩(wěn)定性好的檢測方法,用于衣原體的早期診斷、疫情監(jiān)控、流行病學(xué)調(diào)查等。
參考文獻
[1]Waddlia,Parachlamydia and Chlamydiaceae in bovine abortion[J].Veterinary Microbiology.2011(3)
[2]Detection of Chlamydiaceae DNA in veterinary specimens using a family‐specific PCR[J].K.Condon,J.Oakey.Letters in Applied Microbiology.2007(2)
[3]Chlamydial infections of domestic ruminants and swine:new nomenclature and new knowledge[J].David Longbottom.The Veterinary Journal.2003(1)
[4]Detection of Chlamydia suis from clinical specimens:comparison of PCR,antigen ELISA,and culture[J].Journal of Microbiological Methods.2003(2)
[5]Detection of Chlamydophila(Chlamydia)abortus and Toxoplasma gondii in Smears from Cases of Ovine and Caprine Abortion by the Streptavidin–Biotin Method[J].L.Szeredi,á.Bacsadi.Journal of Comparative Pathology.2002(4)
[6]Genetic Characterization of a Chlamydophila pneumoniae isolate from an African Frog and Comparison to Currently Accepted Biovars[J].Helmut Hotzel,Ernst Grossmann,Frank Mutschmann,Konrad Sachse.Systematic and Applied Microbiology.2001(1)
[7]Multiplex PCR for rapid and differential diagnosis of Mycoplasma pneumoniae and Chlamydia pneumoniae in respiratory infections[J].Daniele Corsaro,Marcello Valassina,Danielle Venditti,Veronique Venard,Alain Le Faou,Pier Egisto Valensin.Diagnostic Microbiology&Infectious Disease.1999(2)
[8]袁曾壯.動物衣原體TaqMan-MGB探針多重?zé)晒舛縋CR方法的建立及應(yīng)用[D].西南大學(xué),2014.