背景及概述^[1]

長梗秦艽，多年生草本，是龍膽科龍膽屬植物，主要分布于我國西藏東部和南部地區(qū)，作為中草藥曾長期用于治療風濕性關(guān)節(jié)炎及肝膽疾病。長梗秦艽酮(waltonitone)是從長梗秦艽中分離得到的一個五環(huán)三萜化合物。有研究表明，長梗秦艽酮能夠抑制肝癌細胞的增殖，同時促進肝癌細胞的凋亡。與此結(jié)果類似，長梗秦艽酮能抑制肺癌A549細胞的增殖并可促進其凋亡，提示長梗秦艽酮是一種潛在的抗腫瘤藥物。

應用^[1-2]

1. 抗肺癌作用

1）長梗秦艽酮抑制H1975細胞的體外增殖：MTT實驗結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的加大，長梗秦艽酮對H1975細胞增殖的抑制作用明顯增加;而且隨著作用時間的增加，長梗秦艽酮對H1975細胞增殖的抑制也增強。這些結(jié)果提示長梗秦艽酮能夠抑制H1975細胞的增殖，且具有劑量和時間依賴性。長梗秦艽酮誘導H1975細胞凋亡在H1975細胞中加入30μmol/L的長梗秦艽酮分別作用24和48h后，通過AnnexinV/PI流式細胞儀雙染法測細胞凋亡的變化。結(jié)果表明，與對照組相比，長梗秦艽酮處理能顯著增加H1975細胞的凋亡，且隨著作用時間的增加，早期凋亡和晚期凋亡細胞的比例都有所增加，說明長梗秦艽酮能誘導肺癌H1975細胞的凋亡(圖2)。

2）長梗秦艽酮引起細胞凋亡的形態(tài)學變化：H1975細胞用30μmol/L濃度的長梗秦艽酮溶液作用后，用Hoechst33342染料對細胞核進行染色，在熒光顯微鏡下觀察顯示，與空白對照相比，長梗秦艽酮作用于H1975細胞24、48h后，細胞形態(tài)變化明顯。隨著藥物濃度增大，細胞數(shù)量減少，細胞核形態(tài)變化顯著，呈現(xiàn)核碎裂、染色質(zhì)邊集等細胞凋亡改變。

3）長梗秦艽酮調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達：H1975細胞用30μmol/L濃度的長梗秦艽酮溶液作用48h后，提取細胞中的總蛋白進行Westernblot實驗。我們篩查了與細胞增殖、凋亡相關(guān)的一系列蛋白表達的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長梗秦艽酮能夠抑制Bcl-2蛋白的表達，同時增加Bax蛋白的表達。如圖4所示，長梗秦艽酮溶液作用后Bcl-2蛋白的表達顯著下降而Bax蛋白表達顯著上升，提示長梗秦艽酮對H1975細胞的凋亡誘導可能是通過對Bcl-2與Bax蛋白的調(diào)節(jié)而實現(xiàn)的。

2. 長梗秦艽酮通過調(diào)節(jié)Akt和ERK1/2通路抑制人肝癌BEL-7402細胞生長。

1）WT對BEL-7402細胞Akt和ERK1/2磷酸化的影響：BEL-7402細胞經(jīng)WT單獨處理或WT聯(lián)合ERK1/2抑制劑PD98059或Akt抑制劑wortmannin處理后，用Westernblot蛋白質(zhì)印跡分析法檢測磷酸化ERK1/2和總ERK1/2，磷酸化Akt和總Akt的蛋白表達。結(jié)果顯示W(wǎng)T(25μmol·L-1)作用1h和2h后，顯著激活BEL-7402細胞ERK1/2和Akt磷酸化，陽性對照藥物EGF(20μg·L-1)也能明顯激活ERK1/2和Akt磷酸化。WT(25μmol·L-1)聯(lián)合PD98059(50μmol·L-1)處理后，ERK1/2磷酸化激活作用被拮抗，而加入wortmannin(1μmol·L-1)對WT激活ERK1/2磷酸化沒有影響。WT(25μmol·L-1)聯(lián)合wortmannin(1μmol·L-1)處理后，Akt磷酸化激活作用被拮抗，而加入PD98059(50μmol·L-1)對WT激活Akt磷酸化沒有影響。

2）WT對BEL-7402細胞活性的影響：不同濃度的WT以及WT聯(lián)合PD98059或wortmannin處理人肝癌BEL-7402細胞48h，用MTT法檢測細胞的活性。結(jié)果顯示W(wǎng)T能夠顯著抑制BEL-7402細胞生長，抑制率隨著濃度增大而增大。同時，WT(25μmol·L-1)，PD98059(50μmol·L-1)，wortmannin(1μmol·L-1)單獨處理對BEL-7402細胞的抑制率分別為77.8%，27.9%，7.6%;WT(25μmol·L-1)與wortmannin (1μmol·L-1)聯(lián)合處理的抑制率為57.2%，WT(25μmol·L-1) PD98059 (50μmol·L-1)聯(lián)合處理的抑制率為72.9%。與WT單獨處理的抑制率相比，以及與WT和抑制劑單獨處理的抑制率單純疊加相比，聯(lián)合處理組的抑制率明顯降低，說明抑制ERK1/2和Akt通路可拮抗WT對BEL-7402細胞的生長抑制作用。

3）WT對BEL-7402細胞周期的影響　流式細胞分析結(jié)果顯示，BEL-7402細胞經(jīng)25μmol·L-1WT處理24h后，細胞周期發(fā)生明顯的變化。和對照組相比，G0/G1期細胞明顯減少，S期細胞明顯增多，G2/M期細胞減少，表明WT處理可使BEL-7402細胞阻滯于S期。抑制劑PD98059(50μmol·L-1)和wortmannin(1μmol·L-1)單獨處理對BEL-7402細胞周期影響較小。與WT(25μmol·L-1)單獨處理組相比，WT(25μmol·L-1)與PD98059(50μmol·L-1)聯(lián)合處理組，WT(25μmol·L-1)與wortmannin(1μmol·L-1)的聯(lián)合處理組S期細胞減少，說明抑制ERK1/2和Akt通路可拮抗WT誘導的S期細胞周期阻滯。

主要參考資料

[1] 長梗秦艽酮對吉西他濱耐藥肺癌H1975細胞的抑制作用及其機制研究

[2] 長梗秦艽酮通過調(diào)節(jié)Akt和ERK1/2通路抑制人肝癌BEL-7402細胞生長