背景[1]
STABLE感受態(tài)細胞是采用大腸桿菌Stable菌株經(jīng)特殊工藝處理得到的感受態(tài)高轉(zhuǎn)化效率菌株，是逆轉(zhuǎn)錄病毒/慢病毒載體系統(tǒng)推薦使用的菌株。基因型：F'proA B lacIq?(lacZ)M15 zzf::Tn10(TetR)?(ara-leu)7697 araD139 fhuA?lacX74 galK16 galE15e14-Φ80dlacZ?M15 recA1 relA1 endA1 nupG rpsL(StrR)rph spoT1?(mrr-hsdRMS-mcrBC)。
特點[2]
1.Stable菌株是是逆轉(zhuǎn)錄病毒/慢病毒載體系統(tǒng)推薦使用的菌株，具有與Stbl2，Stbl3完全不同的基因型，但是表現(xiàn)出比Stbl2，Stbl3更優(yōu)異的性能，特別適合慢病毒或具有末端重復序列DNA片段的克隆。2.含有recA1 rel A1突變，可有效抑制長片段末端重復區(qū)的重組，降低錯誤重組的概率。3.含有核酸酶endA1突變，避免提取質(zhì)粒過程中核酸酶的污染，提高了提取病毒質(zhì)粒的產(chǎn)量和質(zhì)量。4.含有l(wèi)acZΔM15，可用于藍、白斑篩選。
操作方法[3]
1.Stable感受態(tài)細胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，6分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA（質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物）并用手撥打EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰中靜置25分鐘。
2.42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置5分鐘，晃動會降低轉(zhuǎn)化效率。
3.向離心管中加入0.9 mL室溫S.O.C.或LB培養(yǎng)基(S.O.C.營養(yǎng)豐富，可提高轉(zhuǎn)化效率)。
4.30℃，250 rpm復蘇60分鐘。
當質(zhì)粒中含有不穩(wěn)定片段時，30℃培養(yǎng)可降低錯誤重組的概率，若轉(zhuǎn)化control pUC19計算轉(zhuǎn)化效率
則需37℃，225 rpm復蘇60分鐘
5.篩選平板提前拿出放30℃孵育使平板溫度保持30℃，吸取50-100μl直接涂篩選平板或5000 rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應抗生素的S.O.C.或LB培養(yǎng)基上。
6.將平板倒置放于30℃培養(yǎng)20-24小時或37℃過夜培養(yǎng)。
當質(zhì)粒中含有不穩(wěn)定片段時，30℃培養(yǎng)可降低錯誤重組的概率，若轉(zhuǎn)化control pUC19計算轉(zhuǎn)化效率，
則需37℃培養(yǎng)過夜
應用[4][5]
用于E.coli高效感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化體系的建立及誘導型瞬時表達載體的構建
以實驗室種植的擬南芥為試材,通過引物的設計等技術克隆了擬南芥葉片中的誘導型啟動子rd29A片段,通過測序等比對,分析了啟動子中間的不同響應元件。同時利用啟動子rd29A和載體PBI221構建了誘導型植物瞬時表達載體,并通過了酶切檢測。本試驗的主要結果如下:1.試驗比較了不同方法制備的大腸桿菌感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化效率,并優(yōu)化了質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化體系。
結果表明,應用高效法制備的感受態(tài)細胞其轉(zhuǎn)化效率極顯著高于普通大腸桿菌感受態(tài)細胞,轉(zhuǎn)化效率提高了966.1%。-80℃超低溫長期保存時,以7%DMSO為凍存保護劑保存的感受態(tài)細胞其轉(zhuǎn)化效率最高,達到1.1×107,較15%甘油凍存保護劑保存的轉(zhuǎn)化效率提高了69%。溫浴5 min,冰浴10 min時,其轉(zhuǎn)化效率最高,達到4.95×107。并且轉(zhuǎn)化時間縮短至普通大腸桿菌感受態(tài)細胞的12.5%,僅為15 min。2.試驗以擬南芥為試材,設計特異引物克隆得到了擬南芥誘導型啟動子rd29A的基因序列,通過在GenBank上進行核苷酸序列的比對,分析了該啟動子的各個響應元件。結果表示,序列的第370-375堿基之間有5 bp的TATA盒(TATAA),在第737-744堿基間有8 bp的戴帽信號序列(TCAGTCTC),在第302-305和353-356堿基間有CAAT盒和富GC區(qū)域(ATGGGCCAATAG)。
有文獻曾經(jīng)報道過的干旱響應順式作用元件(DRE)(TACCGACAAT)這段序列位于第556-565堿基之間,而報道中的ABA響應元件(ABRE)(ACGTG)則位于第719-724堿基之間。3.試驗構建了誘導型植物瞬時表達載體PBI221-rd29A。通過分析啟動子的酶切位點,試驗利用HindIII和XbaI對啟動子基因片段進行雙酶切處理,同時載體PBI221也用相同的限制性內(nèi)切酶進行酶切處理,將處理產(chǎn)物在T4 DNA連接酶的作用下16℃進行過夜連接,其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞,經(jīng)過培養(yǎng)得到含有載體質(zhì)粒的克隆子。提取所構建載體的質(zhì)粒進行酶切檢測,順利釋放800bp左右目的條帶,證明載體構建成功。同時本試驗還構建了含有水通道蛋白AQP的瞬時表達載體PBI221-AQP,為驗證AQP基因的功能奠定了基礎。
參考文獻
[1]重組大腸桿菌DH5α生產(chǎn)rNGR-Tum-5工藝的研究[D].張怡潔.西北大學2009
[2]超高壓處理對大腸桿菌DH5α遺傳物質(zhì)的影響[D].徐迪.合肥工業(yè)大學2007
[3]大腸桿菌DH5αupp基因的敲除及其應用研究[D].楊奇.南京理工大學2013
[4]孫尚琛.超聲波介導質(zhì)粒pUC19轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化方法及機制的研究[D].蘭州理工大學,2016.
[5]楊坤. E.coli高效感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化體系的建立及誘導型瞬時表達載體的構建[D].西北農(nóng)林科技大學,2010.