背景及概述^[1]

大腸桿菌經(jīng)Ca離子處理后可攝取外源DNA(Plasmid、Phage DNA)，處于這種狀態(tài)的細(xì)胞稱作感受態(tài)細(xì)胞(Competent Cells)。Stable感受態(tài)細(xì)胞是采用Stable菌株經(jīng)特殊工藝制備得到的感受態(tài)細(xì)胞。Stable菌株特別適用于具有末端重復(fù)序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建和擴(kuò)增，也適用于重復(fù)DNA序列的克隆和擴(kuò)增。Stable具有與Stbl3和Stbl4完全不同的基因型，比Stbl3和Stbl4生長速度更快，性能更好。核酸內(nèi)切酶 (endA1)基因的缺失有利于提高質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量。ΔlacZM15基因的存在可用于藍(lán)白斑篩選。菌株還具有抗T1噬菌體感染的特點(diǎn)。Stable感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)pUC19質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率>108 cfu/μg DNA。

菌株抗性^[1]

對氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素、壯觀霉素和呋喃妥因敏感。具有四環(huán)素和鏈霉素抗性。

儲存條件^[1]

-70℃保存，避免反復(fù)凍融。不適合在液氮中保存。臨床應(yīng)用和適應(yīng)癥^[2]

應(yīng)用^[2]

CN201510505278.9報(bào)道了應(yīng)用Stable 感受態(tài)細(xì)胞構(gòu)建含有ccdB的shRNA慢病毒干擾載體。

(1)制備載體骨架pLVX-EF1a-copGFP-Puro：

以pCDF1-MCS2-EF1-copGFP(SBI公司)載體為模板，PCR擴(kuò)增得到EF1a-copGFP片段 (引物序列見表1)，用MluI和AfeI雙酶切PCR產(chǎn)物，然后插入到同樣經(jīng)過MluI和AfeI雙酶切 的慢病毒載體pLVX-Puro(Clontech公司)上，得到載體骨架pLVX-EF1a-copGFP-PGK-Puro。

(2)插入shRNA表達(dá)啟動子：

用ClaI和XhoI雙酶切步驟(1)得到的載體pLVX-EF1a-copGFP-PGK-Puro，去磷酸后 電泳回收；用ClaI和XhoI雙酶切擴(kuò)增hU6啟動子的PCR產(chǎn)物后(引物序列見表2)，連接到 pLVX-EF1a-copGFP-Puro載體的相應(yīng)位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌Stable 感受態(tài)細(xì)胞構(gòu)中，涂LB平板，培養(yǎng)過夜，鑒定后得到的載體為pLVX-hU6-EF1a-copGFP-PGK-Puro。

(3)插入ccdB序列得到三引物退火shRNA慢病毒干擾載體：

以pLenti6載體(Invitrogen公司)為模板，擴(kuò)增出含有大腸桿菌ccdB致死基因的 片段，將擴(kuò)增的到的ccdB用XhoI和Mlu I雙酶切后，與經(jīng)過XhoI和Mlu I雙酶切的pLVX-hU6- EF1a-copGFP-PGK-Puro載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂LB/amp平板，培養(yǎng)過夜， 進(jìn)行菌落PCR及酶切鑒定，得到用于構(gòu)建三引物退火shRNA的慢病毒干擾載體，載體骨架是 pLVX-hU6-ccdB-EF1a-copGFP–PGK-Puro。

主要參考資料

[1] Stable 感受態(tài)細(xì)胞說明書

[2] CN201510505278.9 用于制備shRNA的引物及制備方法、載體及構(gòu)建方法