背景[1-3]
人D-乳酸脫氫酶(D-LDH)ELISA KIT用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗該指標(biāo)抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗該指標(biāo)抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的該指標(biāo)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase）是一類NAD依賴性激酶，有LDHA、LDHB、LDHC三種亞基，可構(gòu)成6種四聚體同工酶。動物乳酸脫氫酶是由4個亞單位組成的四聚體，常見的A、B兩種亞基構(gòu)成的5種LDH同工酶（LDH1-5），C亞基則僅組成一種LDH同工酶即LDH-C4。
乳酸脫氫酶為含鋅離子的金屬蛋白，分子量為135-140kD，是糖無氧酵解及糖異生的重要酶系之一，可催化丙酸與L-乳酸之間的還原與氧化反應(yīng)，也可催化相關(guān)的α-酮酸。大多數(shù)D-乳酸脫氫酶催化是可逆反應(yīng)，極少數(shù)不可逆；對于可逆的D-乳酸脫氫酶來說，只有環(huán)境中乳酸濃度較高時才催化逆反應(yīng)，即催化乳酸合成丙酮酸，來參與細(xì)菌的代謝。LDH廣泛存在于人體組織中，以腎臟含量最高，其次是心肌和骨肌。紅細(xì)胞內(nèi)LDH約為正常血清的100倍。D-乳酸脫氫酶(D-LDH)屬于D-異構(gòu)體特異性2-羥酸脫氫酶家族。酵母中的相似蛋白質(zhì)同時具有D-乳酸和D-甘油酸脫氫酶活性。替代剪接發(fā)生在該基因座，并且已經(jīng)鑒定出編碼不同同工型的兩個轉(zhuǎn)錄物變體。
應(yīng)用[4][5]
用于片球菌屬乳酸菌乳酸脫氫酶生物合成苯乳酸的研究
乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici，P.ac）和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus，P.pe）產(chǎn)PLA的能力，當(dāng)P.ac和P.pe在MRS培養(yǎng)基上30oC培養(yǎng)36h后PLA分別達(dá)到0.65和0.27mmol/L。此外，探究了P.ac產(chǎn)PLA機(jī)理，當(dāng)培養(yǎng)基中添加對應(yīng)氨基酸（苯丙氨酸和酪氨酸）以及酮酸（苯丙酮酸和羥基苯丙酮酸）前體時，PLA和P.ac所產(chǎn)的另一種抑菌物質(zhì)羥基苯乳酸（OH-4-PLA）產(chǎn)量都得到了極大提高，但是這兩種2-羥基酸都會受到非對應(yīng)前體的抑制。
隨著對應(yīng)和非對應(yīng)前體添加量增加，促進(jìn)和抑制作用都會增強(qiáng)，其中酮酸促進(jìn)對應(yīng)2-羥基酸產(chǎn)物的作用強(qiáng)于氨基酸，研究表明其原因是由于酮酸是對應(yīng)2-羥基酸的最直接底物緣故；而氨基酸抑制非對應(yīng)2-羥基酸作用強(qiáng)于酮酸，其原因是由于P.ac和P.pe發(fā)酵產(chǎn)PLA過程中氨基酸競爭共同的酶（氨基轉(zhuǎn)移酶）的底物結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而抑制后續(xù)反應(yīng)的進(jìn)行，最終導(dǎo)致PLA合成受限制。乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，D-LDH）是LAB中轉(zhuǎn)化底物苯丙酮酸（Phenypyruvate，PPA）生成PLA的主要酶。
將P.ac和P.pe中可能存在的D-型乳酸脫氫酶（D-1actate dehydrogenase，D-LDH）基因克隆到質(zhì)粒pET-22b（+）中，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21（DE3）中，通過誘導(dǎo)表達(dá)并純化出兩個重組D-LDH，分別為PaLDH和PpLDH。通過對PaLDH酶學(xué)性質(zhì)研究表明PaLDH在30°C pH5.5時酶活，以PPA和丙酮酸（Pyruvic acid，PA）為底物時酶活分別為140和422.1U/mg，米氏常數(shù)Km為2.92mmol/L，轉(zhuǎn)化常數(shù)kcat為305s-1，催化常數(shù)kcat/Km為105（mmol/L）-1s-1。PpLDH酶學(xué)性質(zhì)研究顯示其在45°C pH5.5時酶活，動力學(xué)參數(shù)分別為Km1.73mmol/L、kcat173s-1和kcat/Km100（mmol/L）-1s-1。
參考文獻(xiàn)
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